Gli1對TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞間質轉分化和膠原合成的影響

李紅微，王志奇，張 菊，郭 鑫

糖尿病腎病作為臨床上十分常見的糖尿病并發癥之一，是終末期腎病發生的重要誘因，以腎臟纖維化為主要病理變化[1]。腎小管上皮細胞間質轉分化和膠原合成是腎臟纖維化發生的機制之一，受到細胞內多種基因和信號的共同調控作用[2]。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是公認的促進腎臟纖維化發生的誘導因子，能夠誘導腎小管上皮細胞發生間質轉分化，這也是其誘導腎組織纖維化的重要途徑之一[3-4]。鋅指轉錄因子1(glioma associate oncogene homolog 1, Gli1)是廣泛存在于人類組織和器官中的調控因子，在細胞分化、間質轉分化和運動等過程中具有關鍵作用[5]。有研究顯示，Gli1參與部分疾病的發生和發展，在心肌纖維化和腎組織纖維化等纖維化疾病中發現Gli1過度表達，并且Gli1表達水平還與組織纖維化程度密切相關[6-7]。本研究探討Gli1對TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞間質轉分化和膠原合成的影響，以期為腎小管纖維化機制研究提供依據。

1 材料與方法

1.1材料 qRT-PCR試劑購自大連寶生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；Gli1抗體購自美國Abcam；纖維連接蛋白(fibronectin, FN)和Ⅰ型膠原酶(collagen type Ⅰ, Col Ⅰ)含量檢測試劑盒均購自上海瑞齊生物科技有限公司；α-SMA抗體和Ras相關C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)抗體購自美國Proteintech；慢病毒介導的Gli1干擾載體(Gli1 shRNA)及其陰性對照(shRNA)由上海生博生物醫藥科技有限公司合成；腎小管上皮細胞NRK-52E購于美國ATCC，細胞培養于10%胎牛血清的DMEM中。

1.2TGF-β1誘導后腎小管上皮細胞中Gli1表達水平檢測 腎小管上皮細胞在實驗0 h時用0 μg/L的TGF-β1細胞培養液和5 μg/L的TGF-β1細胞培養液處理，分別記為Control組和TGF-β1組，培養24 h以后，采用qRT-PCR和Western blot分別檢測細胞中Gli1表達水平。

qRT-PCR檢測：取Control組和TGF-β1組細胞，利用Trizol試劑提取細胞總RNA。RNA濃度和純度測定采用紫外分光光度計。配制逆轉錄體系，包含4 μl的5×Prime Script Buffer，1 μl的Prime Script RT Enzyme Mix，1 μl的Oligo dT primer，1 μl的Random 6 mers，1 μg的總RNA，12 μl的RNase Free dH2O，逆轉錄條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s，逆轉錄產物保存在-20℃。PCR體系包含12.5 μl的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，1 μl的上下游引物，2 μl的cDNA，8.5 μl的dH2O。PCR反應程序為95℃反應30 s，95℃反應5 s，60℃反應30 s，共循環40次。待測基因的mRNA表達水平根據2-ΔΔCt法計算。引物序列為Gli1上游引物為5'-CTGGACCTGCAGACGGTTATC-3'，下游引物為5'-AGCCCTCCTGGAGATGTGCAT-3'。GAPDH上游引物為5'-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'，下游引物為5'-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。

Western blot檢測：分別取Control和TGF-β1組細胞，在細胞中添加蛋白裂解液，提取細胞中的總蛋白。根據說明書用BCA蛋白含量檢測試劑盒分別檢測蛋白樣品的濃度。SDS-PAGE凝膠按照每個泳道50 μg蛋白樣品進行上樣，Marker添加3 μl。首先設置80 V的電壓進行電泳，直到溴酚藍馬上要進入分離膠以后，把電壓調整到100 V，觀察溴酚藍進入到玻璃板的底端以后，把電源關閉。取出凝膠，在250 mA恒流條件下轉膜1 h。將電轉之后的NC膜置于提前配制好的封閉液(5%牛血清白蛋白)中，置于室溫條件下結合2 h；再將NC膜置于已經配制好的一抗溶液內，置于4℃密封過夜；取出NC膜，放在二抗反應液中，室溫孵育1 h。添加電化學發光試劑，凝膠成像儀拍照以后，根據Quantity One分析目的條帶灰度值與內參GAPDH灰度值的比值，對目的蛋白進行半定量分析。

1.3慢病毒感染 將腎小管上皮細胞接種到12孔板中，細胞密度達到30%～40%，在細胞內加入慢病毒溶液，感染復數為30，培養12 h以后，把孔內的溶液倒掉，然后加入新的培養液，72 h以后，分別觀察細胞的熒光情況，干擾效率高于85%。以5 μg/L的TGF-β1細胞培養液培養感染慢病毒介導的Gli1 shRNA及shRNA細胞，分別記為sh-Gli1+TGF-β1和sh-NC+TGF-β1組。取TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1組細胞，采用1.2中qRT-PCR和Western blot分別檢測Gli1水平以確定干擾效果。

1.4ELISA檢測細胞培養液上清中FN和ColⅠ水平 取Control、TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1組細胞，分別培養24 h以后，吸取培養液上清，用ELISA試劑盒檢測FN和ColⅠ水平，操作步驟均按照試劑盒說明書進行。

1.5Western blot檢測細胞中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Rac1蛋白表達水平 取Control、TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1組細胞，分別培養24 h以后，采用Western blot檢測細胞中α-SMA和Rac1蛋白表達水平，步驟同1.2。

2 結果

2.1TGF-β1誘導后腎小管上皮細胞中Gli1表達 TGF-β1組腎小管上皮細胞中Gli1 mRNA和蛋白表達量均高于Control組，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1和表1。

圖1 TGF-β1誘導后腎小管上皮細胞中Gli1蛋白表達

表1 Control組和TGF-β1組腎小管上皮細胞中Gli1 mRNA和蛋白表達

2.2Gli1 shRNA下調TGF-β1條件下腎小管上皮細胞中Gli1表達 腎小管上皮細胞中Gli1 mRNA和蛋白表達量，TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1 3組總體比較差異有統計學意義(P<0.01)；TGF-β1組與sh-NC+TGF-β1組比較差異無統計學意義(P>0.05)；TGF-β1和sh-NC+TGF-β1組均高于sh-Gli1+TGF-β1組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2和表2。

表2 采用不同處理方式3組腎小管上皮細胞中Gli1 mRNA和蛋白表達

圖2 Gli1 shRNA下調TGF-β1條件下腎小管上皮細胞中Gli1蛋白表達

2.3下調Gli1減弱TGF-β1條件下腎小管上皮細胞中FN和ColⅠ水平 FN和ColⅠ水平，Control、TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1 4組總體比較差異有統計學意義(P<0.01)；Control組均低于TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1組，TGF-β1和sh-NC+TGF-β1組均高于sh-Gli1+TGF-β1組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 采用不同處理方式4組腎小管上皮細胞中FN和ColⅠ水平

2.4下調Gli1減弱TGF-β1條件下腎小管上皮細胞中α-SMA和Rac1蛋白表達 α-SMA和Rac1蛋白表達，Control、TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1 4組總體比較差異有統計學意義(P<0.01)；Control組均低于TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1組，TGF-β1和sh-NC+TGF-β1組均高于sh-Gli1+TGF-β1組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3和表4。

圖3 下調Gli1減弱TGF-β1條件下腎小管上皮細胞中α-SMA和Rac1蛋白表達

表4 采用不同處理方式4組腎小管上皮細胞中α-SMA和Rac1蛋白表達

3 討論

有研究報道，糖尿病腎病發病時，成纖維細胞在腎組織纖維化進程中發揮關鍵作用，而腎小管上皮細胞發生間質轉分化，腎小管上皮細胞轉化為成纖維細胞是糖尿病腎病發生主要原因之一[8]。TGF-β1是最常見的一種腎組織纖維化發生誘導因子，在腎組織纖維化發生時表達上調，有促進腎小管上皮細胞間質轉分化和膠原合成作用[9]。本研究結果顯示，腎小管上皮細胞經過TGF-β1處理，細胞中的間質細胞標志物表達上調，細胞分泌的細胞外基質和膠原水平升高，這與上述研究報道一致，說明TGF-β1能夠促進腎小管上皮細胞纖維化進程。

上皮間質轉分化是上皮細胞向間質細胞轉變的標志，生理狀態下上皮間質轉分化對胚胎發育等有重要意義，病理狀態下上皮間質轉分化能誘導纖維化等疾病發生[10]。腎小管上皮細胞間質轉分化發生與間質特性出現有關，α-SMA是間質細胞特異性標志物，在正常組織和器官中表達水平較低，而在組織或細胞上皮間質轉分化過程中表達上調[11-12]。有研究表明，α-SMA陽性表達水平高低與組織纖維化程度呈正相關，細胞大量表達α-SMA是上皮細胞和間質細胞轉化的標志[13]。Rac1有調控細胞動力、周期及細胞黏附等作用，屬于小G蛋白家族成員之一，Rac1水平升高后能夠激活細胞游走，促進上皮細胞去極性進程，進而誘導細胞發生上皮間質轉分化[14]。腎組織纖維化發生直接原因是細胞外基質過量合成，腎小管上皮細胞在腎組織纖維化過程中能夠合成大量FN和ColⅠ，誘導纖維化發生[15]。本研究結果顯示，下調Gli1以后的腎小管上皮細胞合成FN和ColⅠ減少，α-SMA和Rac1表達水平降低，提示下調Gli1能夠抑制腎小管上皮細胞間質轉分化和膠原合成。

本研究結果顯示，TGF-β1誘導后腎小管上皮細胞中Gli1表達上調，并且下調Gli1能夠減慢腎小管上皮細胞的纖維化進程。Gli1是Hh信號通路的關鍵調控因子，具有多種生物學功能，現發現其在組織內環境穩定和器官形成等過程中發揮作用[16]。Gli1參與炎癥和組織增生等病理學過程，在慢性瘙癢等疾病發生中扮演關鍵角色[17]。已有研究報道，腎組織纖維化進程中Gli1高表達，Gli1可促進腎組織纖維化[7]。本研究結果闡明了Gli1在腎小管上皮細胞間質纖維化過程中的作用，為今后腎組織纖維化機制研究提供了參考。

總而言之，TGF-β1誘導后腎小管上皮細胞中Gli1表達上調，下調Gli1表達具有抗腎小管上皮細胞纖維化進程的功能，Gli1可能具有誘導腎組織纖維化的作用，這為臨床研究Gli1調控腎組織纖維化進程的具體機制提供了參考。