缺血性腦卒中患者血清miR-17-5p、miR-27b-3p水平及其對中重度顱內外動脈狹窄預測價值

徐 麗，毛居旦·阿不力孜，楊 麗

缺血性腦卒中是一種因腦組織供血障礙引起腦組織壞死從而導致神經功能障礙的臨床綜合征，約占所有卒中的70%，近年其發病率逐年升高，給社會及家庭帶來嚴重負擔[1]。有研究顯示，缺血性腦卒中的發病因素較多，顱內外動脈狹窄是其發病重要病理生理基礎[2]。顱內外動脈狹窄通常由動脈粥樣硬化引起，隨著動脈粥樣硬化發展，顱內外動脈狹窄發生概率逐漸升高，患者發生缺血性腦卒中風險也隨之加大[3]。因此，臨床上對顱內外動脈狹窄的評估顯得尤為重要。有研究發現，微小RNA(miRNA)作為一種基因調控分子，在缺血性腦卒中的發生和發展過程中發揮重要作用，有望作為缺血性腦卒中診斷的新型生物學標志物[4]。然而，目前有關血清miRNA水平與缺血性腦卒中患者顱內外動脈狹窄程度關系方面的研究及血清miRNA水平檢測對顱內外動脈狹窄診斷價值方面的研究較少。本研究探討缺血性腦卒中患者血清miR-17-5p、miR-27b-3p水平及其對中重度顱內外動脈狹窄預測價值，旨在為缺血性腦卒中的早期診斷及防治提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年1月—2020年6月新疆維吾爾自治區人民醫院收治的符合納入及排除標準的缺血性腦卒中136例的臨床資料。納入標準：①符合缺血性腦卒中診斷標準[5]，且均經頭顱CT或MRI檢查確診；②性別不限，年齡≥18歲；③首次發病，發病至入院時間≤72 h，且入院前未接受過溶栓治療；④臨床資料完整；⑤患者和(或)其家屬簽署相關知情同意書。排除標準：①因非動脈粥樣硬化因素導致的缺血性腦卒中患者；②有神經系統疾病史患者；③合并重要臟器功能障礙和惡性腫瘤患者；④合并血液系統或自身免疫系統疾病患者。本研究符合“赫爾辛基宣言”，并經醫院醫學倫理委員會批準同意執行。

1.2研究方法

1.2.1一般資料收集：收集入選患者性別、年齡、體質量指數(BMI)、基礎疾病(高血壓病、糖尿病和心房顫動)、發病至入院時間、入院時美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評分、吸煙史和飲酒史。吸煙史：每天吸煙≥1次，持續時間≥2年；飲酒史：平均每日飲酒量≥50 g，持續時間≥1年。

1.2.2一般實驗室指標檢測：入選患者一般實驗室指標檢測均于入院后24 h內完成。采集入選患者晨起肘靜脈血5 ml，2500 r/min離心5 min，分離血清后，低溫保存待測。采用全自動生化分析儀(7020型，日本日立有限公司生產)檢測入選患者一般實驗室指標，包括尿酸、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.2.3血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平檢測：采集入選患者晨起肘靜脈血5 ml，2500 r/min離心5 min，分離血清后，低溫保存待測。應用miRNeasy Mini Kit試劑盒(德國QIAGEN公司生產)提取血清總RNA，采用紫外分光光度計(DU800型，美國貝克曼庫爾特有限公司生產)測定RNA濃度及純度，檢測波長為260或280 nm，以稀釋RNA的無酶水為空白對照，吸光度值為1.8～2.1表明RNA質量合格?？俁NA經凝膠電泳分離、純化，后逆轉錄為互補DNA(cDNA)，逆轉錄條件為16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、10 min，獲得cDNA后于-20℃保存備用。應用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒(天根生化科技有限公司生產)，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平，反應體系：2×miRcute miRNA Premix 10 μl、0.4 μl正向引物(10 μmol/L)、0.4 μl反向引物(10 μmol/L)、2 μl miRNA第1鏈cDNA、1.6 μl ROX參比染料(50×)、5.6 μl雙蒸水，總反應體系20 μl；循環參數：94℃預變性2 min為1個循環;94℃ 20 s、60℃ 34 s，共計43個循環。miRNA表達結果采用2-ΔΔCt計算[6]，每個樣本檢測3次，取平均值。

1.2.4數字減影血管造影(DSA)檢查：應用DSA機(Artic Zee Ceiling，德國西門子股份有限公司生產)對入選患者顱內外動脈狹窄情況進行檢查，采用改良Seldinger技術穿刺患者一側股動脈，插入5F動脈鞘行主動脈弓造影，Hunter導管分別置于雙側頸總動脈、椎動脈和頸內動脈，注入造影劑(碘海醇)后造影。造影劑注入速度為5～20 ml/s，總量為5～30 ml，壓力為200～700 Pa。

1.2.5顱內外動脈狹窄情況評估：由2名經驗豐富的影像科醫師對DSA圖像進行雙盲分析，對不確定的影像資料，采取協商方式統一意見。血管狹窄率=(正常血管直徑-狹窄部位最小直徑)/正常血管直徑×100%，以血管狹窄率<30%為輕度狹窄，血管狹窄率30%～70%為中度狹窄，血管狹窄率≥70%為重度狹窄[5]。根據顱內外動脈是否狹窄將入選的缺血性腦卒中136例分為狹窄組和對照組兩組，根據顱內外動脈狹窄程度將狹窄組分為輕度狹窄組、中度狹窄組和重度狹窄組3個亞組。

2 結果

2.1狹窄組和對照組臨床資料比較 缺血性腦卒中136例經DSA檢查共檢出顱內外動脈狹窄95例(狹窄組)，無顱內外動脈狹窄41例(對照組)。狹窄組血清尿酸、TC、LDL-C、miR-17-5p和miR-27b-3p水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。兩組性別、年齡、BMI、基礎疾病、發病至入院時間、入院時NIHSS評分、吸煙史、飲酒史和血清TG、HDL-C水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2不同顱內外動脈狹窄程度缺血性腦卒中3組臨床資料比較 顱內外動脈狹窄95例中，共檢出輕度狹窄28例(輕度狹窄組)，中度狹窄31例(中度狹窄組)，重度狹窄36例(重度狹窄組)。不同顱內外動脈狹窄程度缺血性腦卒中3組血清尿酸、TC、LDL-C、miR-17-5p和miR-27b-3p水平總體比較差異有統計學意義(P<0.01)；性別、年齡、BMI、基礎疾病、發病至入院時間、入院時NIHSS評分、吸煙史、飲酒史和血清TG、HDL-C水平總體比較差異無統計學意義(P>0.05)。血清尿酸、TC、LDL-C、miR-17-5p和miR-27b-3p水平輕度狹窄組和中度狹窄組低于重度狹窄組，輕度狹窄組低于中度狹窄組，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 不同顱內外動脈狹窄程度缺血性腦卒中3組臨床資料比較

2.3血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者聯合檢測對缺血性腦卒中患者中重度顱內外動脈狹窄預測價值 繪制ROC曲線分析血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者聯合檢測對缺血性腦卒中患者中重度顱內外動脈狹窄的預測價值，結果顯示對缺血性腦卒中患者中重度顱內外動脈狹窄預測價值的AUC血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者聯合檢測分別為0.677、0.688和0.804，血清miR-17-5p和miR-27b-3p二者聯合檢測明顯高于單獨檢測(P<0.05)，見圖1和表3。

圖1 血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者聯合檢測對缺血性腦卒中患者中重度顱內外動脈狹窄預測價值的受試者工作特征曲線

表3 血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者聯合檢測對缺血性腦卒中患者中重度顱內外動脈狹窄預測價值的受試者工作特征曲線分析結果

3 討論

流行病學研究發現，20%～48%的缺血性腦卒中由顱內外動脈狹窄引起，且多數復發性病例也發生于相同的動脈狹窄供血區域[7-8]?；颊甙l生動脈粥樣硬化后，斑塊內新生血管破裂后形成血栓，使動脈狹窄或完全阻塞，導致腦部供血中斷，引發缺血性腦卒中；此外，顱內外動脈狹窄造成慢性腦灌注不足也增加了缺血性腦卒中的發生風險[9-10]。因此，準確評估顱內外動脈狹窄程度對缺血性腦卒中臨床治療具有重要意義。

miRNA廣泛參與機體基因表達轉錄后的調控過程，在免疫損傷、神經退行性疾病和腫瘤等的發生和發展過程中發揮重要作用?，F有研究顯示，miR-17-5p表達異常與心肌梗死后血管形成有關[11]；miR-27b-3p在肥胖人群中呈高表達，在棕色脂肪細胞分化過程中發揮重要調節作用，是治療肥胖和胰島素抵抗的潛在靶點[12]。本研究分析缺血性腦卒中患者血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平，結果顯示狹窄組miR-17-5p和miR-27b-3p水平均高于對照組，差異有統計學意義。提示顱內外動脈狹窄缺血性腦卒中患者血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平較高，血清miR-17-5p和miR-27b-3p可能為評估顱內外動脈狹窄的潛在生物學標志物。Tan等[13]以動脈粥樣硬化小鼠為研究對象進行研究，發現動脈粥樣硬化小鼠血清miR-17-5p水平明顯升高，極低密度脂蛋白受體(VLDLR)水平有所下降；且拮抗miR-17-5p后，動脈粥樣硬化小鼠VLDLR下降情況有所恢復，推測VLDLR是miR-17-5p的直接靶點，miR-17-5p抑制劑可通過上調血清VLDLR水平，緩解動脈粥樣硬化病理改變情況。極低密度脂蛋白(VLDL)由TC、TG和膽固醇酯等組成，以TG占比最高，當VLDL水平升高時，TC和TG水平也明顯升高，導致缺血性腦卒中發生率升高[14]。本研究結果顯示狹窄組TC水平高于對照組，也證實了這一觀點。miR-27b-3p是血管平滑肌細胞表型轉換的重要調控miRNA，其表達水平升高可抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移[15]。Cheng等[16]研究急性缺血性腦卒中診斷的潛在生物學標志物，發現與健康者相比，急性缺血性腦卒中患者血清miR-27b-3p水平顯著升高，認為血清miR-27b-3p是診斷缺血性腦卒中的良好血源性生物標志物。

本研究進一步分析不同顱內外動脈狹窄程度缺血性腦卒中患者血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平發現，血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平輕度狹窄組和中度狹窄組低于重度狹窄組，輕度狹窄組低于中度狹窄組，差異均有統計學意義。提示血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平與缺血性腦卒中患者顱內外動脈狹窄密切相關，顱內外動脈狹窄程度越高，二者表達水平越高。分析其原因：①缺血性腦卒中發生后，缺血半暗帶內細胞在氧化應激作用下會產生大量自由基，抑制新生血管形成，參與動脈粥樣硬化發病機制，而miR-17-5p在氧化應激中表達上調[17]；②胰島素樣生長因子-1(IGF-1)水平升高與缺血性腦卒中病情有密切關系，IGF-1可刺激血管平滑肌增殖及遷移，促進動脈粥樣硬化形成，使患者發生顱內外動脈狹窄，而miR-27b-3p高表達會影響IGF-1結合蛋白對IGF-1的調控，增加患者發生動脈粥樣硬化的風險，使動脈狹窄程度加重[18]。

本研究ROC曲線分析結果顯示，對缺血性腦卒中患者中重度顱內外動脈狹窄預測價值的AUC血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者聯合檢測分別為0.677、0.688和0.804，血清miR-17-5p和miR-27b-3p二者聯合檢測明顯高于單獨檢測。提示血清miR-17-5p和miR-27b-3p可作為預測缺血性腦卒中患者中重度顱內外動脈狹窄的良好指標。因此，臨床可根據缺血性腦卒中患者血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平評估顱內外動脈狹窄情況，以及時采取相應干預措施，改善患者預后。

總之，血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平與缺血性腦卒中患者顱內外動脈狹窄密切相關，顱內外動脈狹窄程度越高，血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平越高。血清miR-17-5p和miR-27b-3p聯合檢測對缺血性腦卒中患者中重度顱內外動脈狹窄預測價值高于血清miR-17-5p和miR-27b-3p單獨檢測。