南瓜爛果病病原菌的分離與鑒定

劉文杰 王文政 羅 蘭*

（1 青島農業大學植物醫學學院，山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，山東青島 266109；2 濰坊職業學院，山東濰坊 262737）

南瓜為葫蘆科南瓜屬（Cucurbita）一年生草本植物，在世界范圍內廣泛栽培，有較高的經濟價值和觀賞價值（林德佩，2000）。南瓜果實營養豐富，在蔬菜中淀粉含量僅次于豆類及薯芋類作物，并含有較高的VC和蛋白質，其加工品深受糖尿病患者歡迎（胡金宏和張珉，2016）。據FAO統計，2020年全球南瓜產量超過2 000萬t，而我國的南瓜產量約占世界總產量的50%（梁偉 等，2021）。南瓜不僅生長期間受到植物病原菌的侵染（曾臘春和李臘生，2010），采后貯藏期間同樣也會受到真菌侵染造成爛果，而且損失遠遠大于生長期，嚴重影響其經濟價值（韋瑩瑩 等，2012）。2019年露地蔬菜化肥農藥雙減研究課題組對山東省青島膠州采集的南瓜進行貯藏期間的病害調查及病原菌分離，并對致病性進行初步研究，以期為南瓜采后病害的防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離

南瓜爛果樣品于2019年9月采自山東省青島市膠州市西安家溝村，南瓜品種為蜜罐。采用組織塊分離法，并在病處挑取少量菌絲體，轉入PDA平板，28 ℃培養，待長出菌絲后，挑取少量菌絲在PDA培養基上進一步純化，根據形態學觀察和致病性確定為2個菌株，分別命名為Fn和Rn，4℃保存備用。

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 形態學觀察 在PDA平板上活化菌株，挑取少量菌絲于光學顯微鏡下鏡檢。參考許志剛（2009）的方法觀察病原菌形態特征，并對病原菌進行鑒定，初步明確菌株的分類地位。

1.2.2 致病性測定 采用針刺法接種。先將南瓜洗凈，75%乙醇表面消毒，晾干后接種培養好的菌株Fn和Rn菌餅，每個瓜接種3處，以不接種為對照，每處理1個瓜，重復3次，用脫脂棉保濕48 h。觀察和記錄南瓜果實的發病情況。同時，對發病部位組織進行再分離和鏡檢，比對其形態特征是否與接種的菌株一致。

1.2.3 分子生物學鑒定 利用生工生物工程（上海）股份有限公司DNA快速抽提試劑盒進行Fn和Rn菌株基因組DNA的提取，并以此為模板進行PCR擴增。引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。采 用25 μL PCR反應體系：ddH2O 17.25 μL、10× EasyTaqBuffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）2 μL、引物ITS1 1 μL、引 物ITS4 1 μL、DNA 1 μL、EasyTaqDNA Polymerase 0.25 μL。反應程序：94 ℃，3 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，34個循環；72 ℃，10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得序列在NCBI中進行BLAST比對，采用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹，確定菌株的分類地位（劉娟，2014）。

2 結果與分析

2.1 南瓜爛果病病原菌的分離

從自然發病的南瓜果實上分離、純化得到2種病原菌，分別編號為Fn和Rn。Fn在南瓜果實上形成的病斑凹陷，輪紋狀，病斑上有白色的菌絲及孢子（圖1-a）；Fn在PDA培養基上形成白色菌落，呈放射狀生長，氣生菌絲較豐富（圖1-b）。Rn在南瓜果實上形成的病斑為軟腐，按壓易破裂，病斑上著生繁茂的灰白色菌絲，菌絲生長速度快，肉眼可見球形或近球形孢子囊（圖2-a）；Rn在PDA培養基上生長迅速，初期為白色菌落（圖2-b），后期產生黑色孢子囊。

圖1 南瓜爛果病的癥狀與菌株Fn菌落形態

圖2 南瓜爛果病的癥狀與菌株Rn菌落形態

2.2 致病性測定

菌株Fn接種5 d后開始出現病斑，病斑下陷，但不軟腐，其上產生菌絲及孢子，隨著時間延長病斑進一步擴展（圖3），鏡檢為鐮刀菌，發病癥狀與貯藏期自然發病癥狀一致。菌株Rn接種后初期出現水漬狀腐爛，病斑擴展很快，5 d后產生豐富的菌絲及肉眼可見的孢子囊，接種8 d后整個南瓜果實基本腐爛（圖4），鏡檢為根霉菌，發病癥狀與貯藏期自然發病癥狀一致。因此確定菌株Fn和Rn為引起南瓜爛果病的病原菌。

圖3 菌株Fn回接后南瓜發病癥狀

圖4 菌株Rn回接后南瓜發病癥狀

2.3 致病菌的鑒定

2.3.1 形態學鑒定 菌株Fn在PDA培養基上生長緩慢，菌落為白色。經顯微鏡觀察，菌絲有隔，分生孢子梗短、無色（圖5-a）；大型分生孢子多細胞，鐮刀形；小型分生孢子單細胞，橢圓形至卵圓形（圖5-b）。初步鑒定菌株Fn為鐮刀菌（Fusariumspp.）。

圖5 菌株Fn分生孢子梗和分生孢子的形態

菌株Rn在PDA培養基上生長迅速，菌絲茂盛，初期為白色菌落，后期產生肉眼可見黑色孢子囊。經顯微鏡觀察，菌絲無隔，具假根（圖6-a），孢囊梗直立，頂端產生孢子囊，孢囊孢子近球形（圖6-b）。初步鑒定菌株Rn為根霉菌（Rhizopusspp.）。

圖6 菌株Rn假根、孢囊梗和孢囊孢子的形態

2.3.2 分子生物學鑒定 菌株Fn的rDNAITS序列長度為530 bp（GenBank的登錄號為MW467589）。利用Mega 7.0軟件構建系統發育樹（圖7），菌株Fn與腐皮鐮刀菌Fusarium solani（GenBank的登錄號為LC318412.1）在同一分支上，相似度99.24%。結合形態學特征，確定菌株Fn屬于腐皮鐮刀菌Fusarium solani。

圖7 基于rDNA-ITS序列構建的菌株Fn的系統發育樹

菌株Rn的rDNA-ITS序列長度為851 bp（GenBank的登錄號為MW467979）。利用Mega 7.0軟件構建系統發育樹（圖8），菌株Rn與匍枝根霉菌Rhizopus stolonifer（GenBank的登錄號為KM203865.1）在同一分支上，相似度98.26%。結合形態學特征，確定菌株Rn屬于匍枝根霉菌Rhizopus stolonifer。

圖8 基于rDNA-ITS序列構建的菌株Rn的系統發育樹

3 討論與結論

本試驗從發病南瓜果實上分離獲得Fn菌株和Rn菌株，通過對其進行致病性測定和柯赫氏法則驗證，明確其為南瓜爛果病的病原菌，可以在機械傷害存在的條件下，通過傷口侵染引起南瓜果實腐爛。經形態學及分子生物學鑒定，Fn菌株和Rn菌株分別為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）和匍枝根霉菌（Rhizopus stolonifer）。

鐮刀菌種類較多，分為腐生性和寄生性兩類，寄生性的鐮刀菌是世界范圍內分布廣泛的一類真菌，寄主范圍廣，侵染能力強，可侵染植物的根、莖、穗和果實，引起植物的根腐、莖腐等多種病害，如植物生長期間的大白菜枯萎病（閆文雪 等，2018），貯藏期間的馬鈴薯干腐病和芋艿爛果病（楊波 等，2019；趙璐藐 等，2020）。但有關腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）引起南瓜貯藏期病害鮮有報道。鐮刀菌產生的毒素是危險的食品污染物，對人畜健康造成嚴重危害。其毒素的種類及特性有待進一步的研究。

根霉菌是實驗室常見污染菌，還是條件致病菌，可引起食品霉變，在自然界普遍分布且寄主范圍廣泛，常造成多種水果如柑橘、桃、蜜瓜、葡萄、棗、草莓等及甘薯的采后腐爛（胡光耀 等，2019；陳江華 等，2020），但引起南瓜果實腐爛未見報道。南瓜在我國種植面積較大，采后病害不容小覷，在采收時應注意不要造成傷口，貯藏期間保持低溫干燥，有關引起南瓜果實腐爛的其他病原微生物還有待進一步的調查與鑒定。

本文是由腐皮鐮刀菌和匍枝根霉菌引起南瓜爛果病的首次報道。