GABA和CaCl2復配對鹽堿脅迫下番茄幼苗生長、葉綠素熒光參數和活性氧的影響

陳光鑫 丁 棟 李 倩 陳迎雪 王葉寧 呂晨希 高洪波 吳曉蕾

（河北農業大學園藝學院，河北保定 071001）

土壤鹽堿化現象是世界性生態和資源問題，嚴重限制了農業的發展。據不完全統計，我國鹽堿化土壤面積約為990萬hm2（張體彬 等，2017），特別是在我國北方地區，鹽堿脅迫已成為制約農作物產量和品質的主要非生物脅迫因素之一（姜偉，2010）。土壤鹽堿化主要受自然和人為因素共同影響（Li et al.，2015），設施栽培環境由于相對封閉，復種指數高，土壤更易受化肥過量施用及灌溉不足影響而引發次生鹽堿化（Li et al.，2015）。不同于中性鹽脅迫，鹽堿脅迫除引起植物失水萎蔫、營養失衡及離子毒害外，還會造成高pH脅迫（Yang et al.，2007），從而對植物造成更大的傷害。因此，如何有效緩解鹽堿脅迫已成為備受關注的課題。

番茄（Solanum lycopersicumL.）是我國廣泛栽培的一種重要園藝作物。作為番茄生產大國，2017年我國番茄種植面積為132萬hm2，其中近50%為設施栽培。番茄屬中度鹽敏感型園藝作物（Katerji et al.，2000），隨著設施土壤鹽堿化的日益加重，對番茄產量和品質形成了較大的威脅。以往的研究大多集中于鹽脅迫對植物產生的影響（羅達 等，2019；蘇蘭茜 等，2019），針對植物鹽堿脅迫的響應機制研究還較少。在緩解鹽堿脅迫方面，外源物質的添加是提高鹽堿脅迫下植物耐性和作物產量的一種簡單有效的方法（Jin et al.，2019；趙穎 等，2020）。γ-氨基丁酸（GABA）是動物、植物中廣泛存在的一種天然的非蛋白氨基酸，在植物中，GABA作為一種代謝物或信號分子在脅迫條件下的許多生理過程中發揮重要作用（Lang et al.，2016；Zhen et al.，2018），內源GABA可受鹽刺激和外源GABA誘導的影響，提高植物抗鹽脅迫能力（Shelp et al.，2012；Fa?s et al.，2015）。鈣作為植物必需的大量營養元素之一以及胞內重要的第二信使，對于植物逆境響應非常重要（陳立松和劉星輝，1997）。有研究表明施用外源鈣可以降低植物吸收Na+的能力、改善細胞對鹽的適應能力（朱義等，2007）。谷氨酸脫羧酶（GAD）是GABA支路中合成GABA的限速酶（Inatomi &Slaughter，1971），在其C-末端有與鈣調素結合區域（Yin et al.，2015），而逆境脅迫會造成植物胞內或胞外Ca2+濃度積累從而激活GAD，誘導GABA大量積累（Kinnersley &Turano，2000）。但Ca2+在GABA誘導植物抗逆中的具體作用機制尚不清楚。

為此，在前期針對GABA提高番茄耐鹽性研究的基礎上（羅黃穎 等，2011），本試驗以鹽敏感型番茄品種中雜9號為試材（Hu et al.，2009），采用表型差異顯著的鹽堿脅迫濃度（60 mmol ·L-1NaCl+60 mmol·L-1NaHCO3）（梁楊楊 等，2016），研究單獨添加GABA和CaCl2及兩者復配組合對鹽堿脅迫下番茄幼苗生長、葉綠素熒光和活性氧等指標的影響，探討外源GABA和鈣在提高番茄耐鹽堿性過程中相互作用的生理調節機制，為生產中外源物質施用提高番茄耐鹽堿性及相關制劑開發應用提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試材培養與鹽堿脅迫處理

本試驗在河北農業大學西校區園藝學院試驗溫室內進行，供試番茄品種為中雜9號，購自中國農業科學院蔬菜花卉研究所。GABA購自美國Sigma-Adrich公 司，CaCl2、NaCl、NaHCO3均 為分析純試劑。前期預備試驗已篩選出差異顯著的鹽堿脅迫處理濃度。2018年5月23日，將番茄種子催芽后，采用72孔穴盤，使用草炭、珍珠巖混配基質進行育苗，澆灌Hoagland’s營養液（pH值6.5，EC值1.8 mS·cm-1）。6月20日，選取整齊一致且長勢良好的四葉一心幼苗，洗去幼苗根部基質，定植于容積20 L的灰色塑料盆中進行水培，用充氧泵及時補充氧氣，保證番茄幼苗正常生長。用Hoagland’s營養液預培養3 d后，設置如下10個配方進行水培（表1）。每處理3盆，每盆定植50株番茄幼苗。處理后不同時間內取樣測定幼苗的生長及生理指標，生長指標每處理取樣10株，生理指標取樣6株，3次重復。

表1 處理編號及具體處理配方

1.2 測定指標和方法

在處理0、2、4、6 d，每處理固定選取10株幼苗測定株高、莖粗，株高測量部位為幼苗莖基部至頂部生長點，株高生長速率按公式〔（測定株高-前一次測定株高）/前一次測定株高×100%〕計算；莖粗測量部位為莖基部以上2 cm，莖粗生長速率按〔（測定莖粗-前一次測定莖粗）/前一次測定莖粗×100%〕計算。在處理0、2、4、6 d，每處理選取均勻一致的10株幼苗，采用LA-S根系掃描儀測定根長和根數，生長速率計算公式同上。于處理6 d后，每處理選取10株幼苗，稱量全株鮮質量，在烘箱內105 ℃下殺青10 min后在80 ℃烘干至恒重，測定植株干質量。于處理6 d后，每處理隨機選取6株幼苗，采用葉色指數儀（SPAD-502 Plus，日本）測定從上向下數第3片展開葉片SPAD值（葉色指數），葉綠素熒光儀（FluorCam開放式葉綠素熒光成像系統，捷克）測定從上向下數第3片展開葉片葉綠素熒光參數。于處理2、4、6 d，每處理隨機選取6株幼苗從上向下數第3、4片展開葉片，參照Thordal-Christensen等（1997）的方法測定超氧陰離子產生速率和H2O2含量。

1.3 數據分析

試驗數據使用Excel 2007和SAS 8.1軟件進行處理和統計分析，各測定數據均源于3次測試重復結果的平均值。采用單因素和Duncan’s法進行方差分析和差異顯著性比較（P＜0.05），利用Excel軟件繪圖，圖表中數據為平均值 ± 標準誤。

2 結果與分析

2.1 不同GABA和CaCl2 復配組合對鹽堿脅迫下番茄幼苗生長的影響

2.1.1 不同GABA和CaCl2復配組合對鹽堿脅迫下番茄幼苗株高和莖粗生長速率的影響 由圖1-A可知，在整個處理過程中，SA處理的幼苗株高生長速率均顯著低于對照，降低幅度隨脅迫時間延長而逐漸增加，分別達到39.3%、58.3%、67.8%。外源CaCl2和GABA單獨處理和復配處理均可有效緩解鹽堿脅迫對番茄幼苗生長的抑制作用，促進株高生長速率增加。其中CaCl2處理中以SA +Ca6處理的株高生長速率較高，較SA處理提高了24.1%～50.2%，差異顯著；GABA處理中以SA +GABA5處理的株高生長速率較高，較SA處理提高了23.0%～55.3%，差異顯著；復配組合中以SA +Ca6+GABA5的株高生長速率最高，較SA處理提高幅度呈隨脅迫時間延長而上升的趨勢，在處理6 d時達到79.6%。

如圖1-B所示，與對照相比，鹽堿脅迫顯著抑制了番茄幼苗莖粗的增加，處理2、4、6 d時降低幅度分別達到67.8%、77.8%和80.4%，呈現出隨脅迫時間延長降低幅度逐漸增大的趨勢。外源CaCl2和GABA單獨處理和復配處理均可促進幼苗莖粗的增加，但提高幅度差異較大。其中以SA+Ca3+GABA5、SA+Ca6+GABA5復 配組合效果較好，在整個處理過程中莖粗生長速率均高于其他單獨組合和復配組合，相較于SA處理莖粗生長速率分別提高了100.9%～138.6%和103.9%～148.4%，并且相較于其他組合，在脅迫6 d時依然保持了較高的莖粗生長速率。

圖1 鹽堿脅迫下不同GABA和CaCl2 復配組合的株高和莖粗生長速率

2.1.2 不同GABA和CaCl2復配組合對鹽堿脅迫下番茄幼苗根長和根數生長速率的影響 由圖2-A可以看出，SA處理對于幼苗根系伸長有顯著的抑制作用，表現為根長生長速率隨處理時間延長而逐漸下降，整個脅迫過程中較對照降低86.3%、91.9%和94.8%。與SA處理相比，在脅迫6 d時，2個濃度的外源GABA單獨處理對于根長生長速率的提升達到4倍以上，而外源CaCl2單獨處理對于根長生長率的提升僅為2.8倍，表明外源GABA對于根長的緩解作用更好。單獨處理的2個濃度相比，較高濃度的CaCl2和GABA效果均好于較低濃度。復配組合中以SA+Ca6+GABA5的根長生長速率最高，在脅迫6 d時依然保持了較高的增長速率，達到SA處理的6.9倍，且在處理4 d和6 d時，顯著高于其他外源添加處理。

圖2 鹽堿脅迫下不同GABA和CaCl2 復配組合的根長和根數生長速率

SA處理對于幼苗根數的增加也有顯著的抑制作用，與對照相比，根數生長速率的降低幅度分別達到55.0%、71.4%和82.6%（圖2-B）。處理6 d時復配組合對于根數的增加作用好于外源GABA單獨處理，而外源GABA單獨處理好于外源CaCl2單獨處理，最優復配組合為SA+Ca6+GABA5，整個處理期間的根數生長速率最高，其次為SA+Ca6+GABA2.5處理，且2個處理間差異不顯著。

2.1.3 不同GABA和CaCl2復配組合對鹽堿脅迫下番茄幼苗干、鮮質量的影響 由表2可知，SA處理的番茄幼苗鮮質量和干質量與對照存在顯著差異，其中鮮質量較對照降低了32.9%，干質量則下降了13.2%，說明鹽堿脅迫對于植株鮮質量的影響大于對干質量的影響。與SA處理相比，無論是外源GABA單獨處理、外源CaCl2單獨處理，還是復配處理，均顯著增加了幼苗的鮮質量；除SA +Ca3+GABA2.5處理外，各外源添加處理的干質量均顯著高于SA處理。復配處理中以SA+Ca6 +GABA5效果最好，較SA處理鮮質量提高27.7%，干質量提高12.1%。

表2 不同GABA和CaCl2 復配組合對鹽堿脅迫下番茄幼苗干、鮮質量的影響

2.2 不同GABA和CaCl2 復配組合對鹽堿脅迫下番茄幼苗葉色指數和葉綠素熒光參數的影響

由表3可以看出，SA處理的幼苗葉片葉色指數顯著低于對照和其他外源添加處理，其中較對照降低了30.8%。外源GABA單獨處理中SA +GABA5的葉色指數較SA+GABA2.5顯著提高，外源CaCl2單獨處理中SA+Ca6效果好于SA +Ca3。復配處理中SA+Ca3+GABA5葉色指數最高，其次為SA+Ca6+GABA5處理，且兩者差異不顯著。

表3 不同GABA和CaCl2 復配組合對鹽堿脅迫下番茄幼苗葉色指數和葉綠素熒光參數的影響

SA處理的幼苗葉片葉綠素熒光參數與對照差異顯著，表明鹽堿脅迫對幼苗葉片光合系統造成了傷害，主要表現為Fv/Fm、ETR、φPS Ⅱ、qP的顯著降低，而NPQ則顯著上升。各外源添加處理均可顯著影響鹽堿脅迫下幼苗葉片的葉綠素熒光參數，SA+GABA5處理對于葉綠素熒光系統傷害的緩解效果好于2個外源CaCl2單獨處理，表現為ETR顯著高于2個外源CaCl2單獨處理，Fv/Fm、φPS Ⅱ、qP在各單獨處理中最高。復配處理中以SA+Ca6+GABA5和SA+Ca3+GABA5效 果較好，除NPQ外，兩者之間沒有顯著差異。

2.3 不同GABA和CaCl2 復配組合對鹽堿脅迫下番茄幼苗活性氧代謝的影響

如圖3-A所示，鹽堿脅迫處理顯著提高了番茄葉片H2O2含量，整個處理過程中SA處理較對照H2O2含量增加94.5%～127.1%，說明鹽堿脅迫對植株葉片細胞造成了嚴重傷害。與SA處理相比，外源添加GABA和CaCl2均可顯著降低葉片中H2O2含量。與CaCl2單獨處理相比，GABA單獨處理對于H2O2的清除具有更強的持續性，整個處理期間H2O2含量降低幅度均超過20%。復配處理中SA+Ca6+GABA5對于H2O2的清除作用最強，H2O2含量降低幅度達到32.5%～39.5%。

圖3 鹽堿脅迫下不同GABA和CaCl2復配組合的過氧化氫含量和超氧陰離子產生速率

3 討論與結論

生物量降低是鹽脅迫下植物最明顯的表型體現（王素平 等，2006）。鹽堿脅迫誘導滲透脅迫和氧化脅迫，干擾植物代謝，進而限制植物生長發育。已有報道指出外源CaCl2可顯著提高鹽脅迫下大蒜幼苗的株高和根長（Chen et al.，2011）。河北農業大學設施蔬菜課題組前期研究表明，外源GABA施用可提高鹽堿脅迫下番茄幼苗地上部和地下部鮮質量（梁楊楊 等，2016）。本試驗中，GABA和CaCl2單獨使用均有利于鹽堿脅迫下番茄幼苗生長，表現為株高、莖粗、根長和根數生長速率以及干鮮質量的提升。GABA和CaCl2存在濃度效應，整體表現為高濃度（6 mmol·L-1CaCl2、5 mmol ·L-1GABA）好于低濃度（3 mmol·L-1CaCl2、2.5 mmol·L-1GABA）。總體來看，添加5 mmol·L-1GABA對于生物量的提升效果好于添加6 mmol ·L-1CaCl2的處理，說明對于上述濃度來說，GABA對于鹽堿脅迫的緩解作用大于CaCl2，可能的原因是選用的CaCl2單獨處理濃度還未達最適濃度。與單獨添加處理相比，4個復配組合在不同程度上緩解了鹽堿脅迫對幼苗生長的抑制，其中表現最好的是SA+Ca6+GABA5處理，在外源添加處理中幼苗生長指標均達最高，SA+Ca3+GABA5處理表現次之，且在多個時間點與SA+Ca6+GABA5處理無顯著差異。由此可以看出，合理濃度的復配處理整體較單獨處理提高了番茄幼苗的耐鹽堿性，并且緩解效果主要歸功于GABA，當選用較高濃度GABA與不同濃度CaCl2復配時，其組合效果均較好，CaCl2濃度的高低對于復配組合的影響較小。

葉綠素對光合作用至關重要。光合能力下降是鹽堿脅迫下植物生長受到抑制的主要原因。鹽堿脅迫會降低葉片的光合作用（Xiang et al.，2016；Radanielson et al.，2018）。植物中葉綠素的生物合成過程中任何環節出現問題，葉綠素含量就會受到影響（Min et al.，2006；Tanaka &Tanaka，2006）。已有研究表明，GABA處理減輕了脅迫引起的光合作用降低，恢復了葉綠體結構損傷（Xiang et al.，2016）。本試驗發現外源CaCl2、GABA單獨處理和復配處理均可以達到顯著改善葉綠素熒光參數的效果，雖然復配處理組合SA+Ca6+GABA5僅在NPQ指標上與其他外源添加處理有顯著差異，但其參數在各處理間均為最優，說明GABA和CaCl2復配較單獨處理可以有效提高番茄葉片光合能力，主要原因在于GABA和CaCl2均可緩解鹽堿脅迫造成的離子毒害，維持良好的營養元素吸收，從而維持細胞氧化還原平衡，促進葉綠素的正常合成。

活性氧（ROS）是調節植物生長、代謝和應激反應的重要信號分子（Baxter et al.，2014；Liu et al.，2018）。逆境引發的過多活性氧產生與細胞膜損傷和電解質滲漏密切相關（Demidchik et al.，2014）。外源GABA處理能有效地緩解鹽堿脅迫引起的生長限制和膜脂氧化（Jin et al.，2019），但還沒有直接證據表明GABA直接清除ROS來緩解脅迫傷害。因此猜測GABA增強脅迫耐受力可能是通過抗氧化系統介導的。本試驗結果表明，外源GABA可明顯降低鹽堿脅迫下葉片H2O2含量和產生速率。此外，本試驗更加關注的是GABA和CaCl2的復配效果，其中SA+Ca6+GABA5處理的H2O2含量和產生速率最低，說明CaCl2的添加可進一步增強GABA對番茄葉片清除活性氧能力的提高。GABA誘導植物逆境耐性增強與Ca2+調節通路密切相關（Yu et al.，2014）。與鹽脅迫不同的是，鹽堿脅迫造成的高pH環境會加劇根系離子吸收的障礙，迫使胞內環境酸化，脅迫條件下胞質中Ca2+/CaM和H+濃度上升，均可促進GAD的活性使GABA的含量增加（Aurisano et al.，1995）。這也可能是復配處理效果好于單獨處理的原因。

本試驗結果表明，與單獨添加處理相比，復配處理SA+Ca6+GABA5對于鹽堿脅迫傷害的緩解效果更好，說明外源CaCl2的添加對于GABA增強植物耐鹽堿能力有促進作用，但其對于鹽堿脅迫傷害的緩解效應并沒有顯著高于其他復配處理和單獨處理，因此認為復配處理表現的是協同作用而并不是簡單的疊加關系，是代謝調控的結果。CaCl2可能通過代謝調控GABA來誘導植物提高耐鹽堿能力。因此，外源GABA和CaCl2在抗逆過程中如何影響內源GABA和Ca2+的變化，從而更好地發揮協同效應還有待進一步明確，此外，本試驗結果還為GABA與鈣復配制劑在鹽堿土生產上的應用提供了參考。