黃瓜耐鹽脅迫遺傳育種研究進展

劉東讓 董邵云 苗 晗 薄凱亮 張圣平 顧興芳

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黃瓜（Cucumis sativusL.）又名胡瓜、青瓜，屬葫蘆科一年生草本植物，起源于喜馬拉雅山南麓的印度北部地區，在世界各國廣泛栽培。黃瓜也是我國主要蔬菜作物之一，2019年我國黃瓜總產量達7 033.9萬t（FAO，2019），在全球蔬菜產業經濟中占有重要地位。而黃瓜對鹽脅迫十分敏感，過高的土壤含鹽量會對黃瓜的生理生化活動及生長進程造成嚴重影響，進而降低其產量和品質，極大地影響經濟效益（Baysal &Tipirdamaz，2007）。

隨著全球鹽堿地面積的不斷擴大，全球已有超過9.5億hm2的土地受到鹽害的威脅，約占全球土地面積的7%（李建國 等，2012）。目前，我國鹽堿地面積超過3 600萬hm2，約占全國可利用土地的4.9%（張昆 等，2017）。此外，我國設施農業發展較快，連續重茬及半封閉的環境等因素導致了不同程度的土壤次生鹽漬化，多數設施土壤表層鹽分含量超過1.5 g·kg-1，嚴重影響了設施蔬菜作物的正常生長（余海英 等，2005）。鹽堿地和設施生產中的鹽脅迫會導致黃瓜種子活力下降，出芽后的幼胚側根發育不全，黃瓜幼苗整體失水萎縮，地上部干鮮質量下降，葉片黃化枯萎，進而造成產量和品質顯著下降（Chartzoulakis，1992；Ho &Adams，2006；Trajkova et al.，2006；程元霞，2018），嚴重制約了我國黃瓜產業的發展。因此，提高黃瓜的耐鹽性具有重要意義。

本文主要綜述了黃瓜種質資源耐鹽性評價，鹽脅迫對黃瓜生長發育及生理的影響，黃瓜耐鹽性的遺傳分析及相關基因的挖掘，以及提高黃瓜耐鹽性的主要途徑，同時就目前黃瓜耐鹽脅迫育種研究中存在的主要問題及相應對策進行了討論與展望。

1 黃瓜種質資源耐鹽性評價

1.1 黃瓜耐鹽性評價方法

建立準確、高效的黃瓜耐鹽性鑒定體系，是篩選耐鹽種質資源、培育耐鹽品種的關鍵。目前黃瓜耐鹽性的評價工作主要集中在芽期和苗期，芽期鹽脅迫處理方法一般是使用培養皿在恒溫箱中進行，而苗期處理方法主要有田間栽培法、營養液水培法、基質栽培法及組織培養法（潘俏 等，2018）。田間栽培法較為貼近生產實際，表型易鑒定，評價結果更為準確，但鹽處理強度及外界環境等變量不易控制，且時間和工作量要求也相對較大；營養液水培法和基質栽培法最大的優點是處理條件可控，利于鹽脅迫處理梯度設置和變量控制，但對幼苗的生長時期和植株狀態要求較高，且一般用于少量材料的耐鹽性評價；組織培養法利用細胞的全能性，可節省育苗時間，組培苗對鹽脅迫也更為敏感，處理條件更易控制，但可鑒定的表型相對較少，且對試驗技術和設備要求較高（李青 等，2017）。幾種方法各有優劣，可根據試驗材料的數量、試驗目的和試驗條件靈活搭配選用。

黃瓜耐鹽性評價中常用的數據分析方法主要有隸屬函數分析、聚類分析和主成分分析。隸屬函數分析是指將各個指標的測定值轉換為隸屬函數u（x），根據多個指標隸屬函數值的平均值來評價品種的耐鹽性（董志剛 等，2008；徐慧妮 等，2011；曹齊衛 等，2014；潘俏 等，2018）。聚類分析是指根據多項指標數據，采用離差平方和法進行系統聚類，劃分材料的耐鹽性（朱進 等，2006a；董志剛 等，2008；曹齊衛 等，2014）。主成分分析是指將多個評價指標轉換為幾個代表性強的指標作為主成分，依據主成分貢獻率計算品種主成分得分，根據綜合得分評價品種耐鹽性的強弱（李青等，2017）。門立志等（2013）和王喜濤（2014）通過調查黃瓜幼苗葉片受害程度進行耐鹽分級，同時綜合運用聚類分析、隸屬函數分析和主成分分析法，批量完成了多個黃瓜品種的耐鹽評價。王廣印等（2004）和趙桂東等（2014）根據種子發芽率、發芽指數、活力指數及幼胚一級側根數等4個發芽指標的綜合得分對黃瓜種子的耐鹽性進行評價，也是一種較為簡便快速的黃瓜芽期耐鹽性評價方法。

1.2 黃瓜耐鹽性評價結果

黃瓜種質資源的耐鹽性評價需要借助具體的評價指標（表1），由于評價指標的多樣性，黃瓜種質資源的耐鹽性尚未有十分準確的界定標準，只能結合有關報道，初步認定部分種質的耐鹽性（表2）。其中津春4、津研4、07-6、07-9、07-10等5個品種在不同試驗中的評價結果存在差異，這可能是不同的評價方法造成的。此外，邱岸（2013）對111個不同生態類型的黃瓜種子進行鹽脅迫處理，結果顯示黃瓜的耐鹽性為歐美加工型＞華南無刺型＞華南淺綠（白）型＞華北密刺型。曹齊衛等（2014）對不同生態類型的143個黃瓜品種進行耐鹽性鑒定，認為耐鹽性依次為歐美加工型和歐洲溫室型＞華南型＞華北型。

表1 黃瓜耐鹽性鑒定評價指標

表2 黃瓜品種耐鹽性評價結果

2 鹽脅迫對黃瓜生長發育和生理的影響

2.1 鹽脅迫對黃瓜生長發育的影響

研究黃瓜的耐鹽反應是評價黃瓜耐鹽性的基礎，對于黃瓜耐鹽品種的選育具有重要意義。不同程度的鹽脅迫對不同生長發育時期的黃瓜影響不同，目前對黃瓜耐鹽反應的研究主要集中在黃瓜的發芽期、幼苗期及成株期。

研究表明，大部分黃瓜品種的發芽勢、發芽率和相對發芽率隨著鹽濃度的增加而降低，相對傷害率隨著鹽濃度的增加而加大（邱岸 等，2013；沈季雪和蔣景龍，2017）。而畢靜靜等（2012）、程李香等（2012）和王喜濤（2014）分別在30、25 mmol·L-1和50 mmol·L-1的低鹽濃度脅迫下，發現個別黃瓜品種出現了發芽率和發芽勢顯著上升的情況。

鹽脅迫對黃瓜幼苗期的傷害主要表現在黃瓜幼苗生長受到明顯抑制，株高、莖粗、根長、葉片數、最大葉長、最大葉寬及植株干質量、鮮質量和含水量等均不同程度降低，且隨著鹽濃度及處理時間的增加，葉片也會表現出明顯的黃化癥狀，植株萎蔫及死亡速度顯著加快（沈季雪 等，2016；程元霞，2018）。此外，王素平等（2006）和朱進等（2006b）均發現25 mmol·L-1鹽濃度是鹽敏感黃瓜幼苗是否受劇烈鹽傷害的參考臨界值，而耐鹽黃瓜品種的幼苗則在50 mmol·L-1濃度鹽脅迫下才會表現出顯著的鹽害反應。

黃瓜成株期耐鹽性的研究，主要集中在對黃瓜產量及品質的影響兩方面。研究發現當鹽濃度超過0.91 g·L-1時，鹽濃度每上升0.7 g·L-1，黃瓜產量降低15.9%（Chartzoulakis，1992）。Ho和Adams（2006）的研究表明3.85 g·L-1的鹽濃度是黃瓜果實干質量下降的臨界值。Trajkova等（2006）的研究表明，在2.1 g·L-1和3.5 g·L-1鹽濃度下，黃瓜產量隨鹽濃度增加而降低，同時發現果實可溶性固形物的含量顯著增加。呂慧娟（2006）以耐鹽黃瓜品種中農12號為材料，發現在鹽濃度＜2.97 g·L-1時，黃瓜果實的可溶性糖、膳食纖維以及VC含量隨著鹽濃度的升高而顯著增加。黃遠（2010）發現在30 mmol ·L-1和60 mmol·L-1鹽脅迫下，鹽敏感黃瓜品種津春2號的果實中可溶性糖含量也上升。因此，雖然鹽脅迫會降低黃瓜的產量，但會在一定程度上提高部分黃瓜品種的品質，然而，不同黃瓜品種的各項品質指標變化存在差異，需要進一步探究。

2.2 鹽脅迫對黃瓜生理生化特性的影響

植物在高鹽環境中會受到兩種類型的脅迫，一種是滲透勢的變化導致水分吸收減少而引起的植物失水，另一種是由于土壤有毒離子如Na+的積累而引起的離子毒性（Gong et al.，2020）。這兩種脅迫對黃瓜生理生化指標的影響主要通過滲透調節、光合作用、氧化脅迫及其他作用途徑（圖1）。滲透調節途徑主要指鹽脅迫引起的黃瓜丙二醛（MDA）積累，細胞膜透性增大，胞內的電解質及其他小分子物質大量外滲，相對電導率增大（沈季雪 等，2016；張環宇，2018；賴偉 等，2020），地上部和地下部Na+/K+、Na+/Ca2+比值均顯著升高（燕飛等，2014；劉云芬 等，2019），脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖類和可溶性蛋白等滲透調節物質增加（邵俏賽，2015）。光合作用途徑主要指鹽脅迫導致黃瓜光合色素（葉綠素和類胡蘿卜素）、凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）和胞間CO2濃度（Ci）等光合指標下降（Baker，1991；束勝 等，2012；Shu et al.，2012a）。氧化脅迫途徑主要指鹽脅迫下黃瓜中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）和轉谷氨酰胺酶（TGase）等抗氧化酶的活性提高，且隨著鹽濃度的增加呈現先上升后下降的趨勢（Naliwajski &Skodowska，2014；張海軍，2016；賴偉 等，2020；姚佳麗 等，2020；Shu et al.，2020）。其他作用途徑包括黃瓜生理結構的改變，葉綠體變形，基質類囊體片層結構垛疊程度下降，淀粉粒變小且數量減少，出現大量嗜鋨顆粒（童輝 等，2012；Shu et al.，2012b），以及ABA和IAA等激素水平的上升（李曉輝，2014；孫士濤，2017；Chen et al.，2017）。

圖1 鹽脅迫對黃瓜生理生化特性的影響

3 黃瓜耐鹽性的遺傳分析及相關基因的挖掘

黃瓜耐鹽性是由多基因控制的，遺傳規律非常復雜。李艷茹和司龍亭（2011）以黃瓜耐鹽自交系和不耐鹽自交系為親本，構建6世代群體，采用數量性狀主基因+多基因模型分析法，發現黃瓜幼苗耐鹽性遺傳受1對加性-顯性主基因+加性-顯性-上位性多基因控制。王喜濤（2014）以黃瓜幼苗地上部鮮質量為指標，發現耐鹽性在F2分離群體中符合正態分布，表明黃瓜耐鹽性屬于多基因控制的數量性狀，符合加性-顯性遺傳模型，主要由基因加性效應控制。Liu等（2021）發現黃瓜幼苗鹽害指數在重組自交系（recombinant inbred lines，RILs）群體中也呈正態分布，認為黃瓜幼苗耐鹽性屬于多基因控制的數量性狀。

目前黃瓜耐鹽性相關基因挖掘及分子響應機制方面的研究較少，缺乏耐鹽分子標記和基因定位研究。Liu等（2021）通過評價RILs群體的苗期耐鹽性，檢測到1個與鹽害指數相關的主效QTL，該位點位于6號染色體上，這是目前首個報道控制黃瓜苗期耐鹽性的QTL。其他研究主要集中在鹽脅迫處理下，已知耐鹽相關基因在黃瓜中轉錄水平的變化（表3）。這些基因在黃瓜中的表達變化與其在擬南芥中的變化趨勢基本一致，推測SOS（saltoverly-sensitive，超鹽敏感）、ABA等調控途徑在黃瓜耐鹽響應中的作用機制與擬南芥類似，需要進一步驗證。轉錄因子方面，王立偉（2017）發現與擬南芥鹽響應蛋白AtGT-3b同源的黃瓜轉錄因子CsGT-3b，可以與CsSAMs基因啟動子的鹽誘導元件GT-1互作，通過調控CsSAM基因的表達來響應鹽脅迫。朱永興（2016）利用RNA-seq技術對鹽脅迫處理下的黃瓜根系和葉片進行轉錄組深度測序，發現ERF（ethylene responsive factor）、WRKY和MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）等205個轉錄因子在鹽脅迫下存在差異表達。白雪（2020）發現在鹽脅迫下，WRKY轉錄因子家族基因CsWRKY46的表達量在黃瓜葉片和根部均顯著上調。李巧麗（2020）發現NaCl脅迫處理6 h后，轉錄因子家族基因MYB108、ERF4、ABCG3和ABCI7的表達量顯著上調，而WRKY19和WRKY54則在NaCl處理48 h后顯著上調，說明黃瓜中存在復雜的轉錄調節網絡來應對外界鹽脅迫。

表3 植物耐鹽相關基因在鹽脅迫下黃瓜轉錄水平上的分析

此外，有研究以黃瓜、擬南芥和煙草為材料，通過轉基因的方式分析驗證耐鹽相關基因在黃瓜中的功能（表4），這對于研究黃瓜的耐鹽反應及通過基因工程培育黃瓜耐鹽品種具有重要意義。

表4 黃瓜耐鹽相關基因的轉化分析

4 提高黃瓜耐鹽性的途徑

4.1 嫁接

嫁接是目前提高黃瓜耐鹽性應用最為廣泛、有效的途徑，現階段主要使用南瓜作為砧木。它可以從滲透調節、光合作用、抗氧化酶調節及內源激素調節等多個途徑綜合提升黃瓜對鹽脅迫的響應強度，進而提高黃瓜的耐鹽性。滲透離子方面，南瓜砧木具有較高的Na+外排和根系保留能力，可降低Na+向地上部的轉運，同時促進植株對K+、Ca2+和Mg2+的吸收，改善離子含量比例，從而提高黃瓜的耐鹽性（王永傳，2006；Huang et al.，2013；Sun et al.，2018）。滲透調節物質方面，在鹽脅迫下嫁接黃瓜中游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白質含量均高于自根黃瓜（姜濤 等，2008）。此外，王麗萍等（2012）發現白籽南瓜砧木嫁接可調節黃瓜植株體內氮素代謝，提高滲透調節能力，有效地緩解鹽脅迫對黃瓜植株的傷害。光合作用方面，以南瓜為砧木的嫁接黃瓜植株凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和葉綠素含量等光合作用指標均顯著高于黃瓜自根植株（王永傳，2006；楊立飛 等，2006；姜濤 等，2008）。抗氧化酶調節方面，高俊杰等（2008）發現在鹽脅迫下，嫁接黃瓜葉片Cu/Zn-SOD mRNA、Mn-SOD mRNA和CAT mRNA的相對表達量均高于自根黃瓜，SOD、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT活性也均高于自根黃瓜，而嫁接黃瓜葉片MDA含量和電解質滲漏率均低于自根黃瓜，說明嫁接黃瓜具有較高的活性氧清除系統，可以減少活性氧物質的危害，提高其耐鹽性。內源激素調節方面，楊立飛（2007）的研究結果表明，NaCl脅迫下，嫁接植株脫落酸（ABA）含量一直表現為上升趨勢，而自根植株則表現為先上升后下降，嫁接植株積累ABA較快，并且在鹽脅迫初期表現明顯，嫁接苗對鹽脅迫有較快的感知性，通過信號轉導，快速啟動一系列抗逆相關基因的表達，調控植株應答逆境環境。

4.2 化學物質或外源激素誘導

使用化學物質提高植物的耐鹽性也是一種較為常用的方法。研究表明，氯化膽堿、氯化鈣、過氧化氫、富氫水以及一定量的微量元素等外源物質可以在一定程度上緩解黃瓜的鹽脅迫傷害，促進黃瓜種子萌發與幼苗生長（張永平，2011；馬宗琪 等，2012；張海那，2018；朱利君 等，2019；馬嘉偉 等，2020）。施用外源腐胺、亞精胺等多胺可有效緩解鹽脅迫對黃瓜種子和幼苗的傷害，提高其耐鹽性（杜靜，2016；張鋮鋒 等，2019；王丹怡 等，2020）。外源NO可以顯著緩解鹽脅迫對黃瓜幼苗生長的抑制，同時可以顯著提高幼苗的可溶性蛋白含量，增強SOD、POD、CAT的活性，從而減輕黃瓜幼苗鹽脅迫下造成的氧化損傷，提高黃瓜的耐鹽性（樊懷福，2007；張愛慧 等，2011）。

外源激素對提高植物的耐鹽性也有一定的作用，在鹽脅迫下對黃瓜幼苗外施ABA、水楊酸（SA）、表油菜素內酯（EBL）及赤霉素（GA）等激素，可以緩解相對電導率、葉綠素和丙二醛含量的變化，提高光合作用，同時增加POD和SOD的活性，從而提高黃瓜的耐鹽性（鐘新榕 等，2005；安亞虹，2016；張環宇，2018；Miao et al.，2020）。此外，孫彤彤等（2019）使用溫湯浸種的方法，發現外源SA浸種、油菜素內酯（BR）浸種以及SA+BR復配浸種3種處理方式，均提高了鹽脅迫下黃瓜幼苗凈光合速率、氣孔導度和胞間CO2濃度，其中SA+BR復配浸種的作用效果介于兩個單劑處理之間。

4.3 生物誘導

黃瓜生長環境中的部分微生物也可以提高黃瓜的耐鹽性。研究表明叢枝菌根真菌（AMF）可顯著促進鹽脅迫下黃瓜幼苗體內滲透調節物質的積累，提高抗氧化酶活性，有效降低體內膜脂過氧化水平，緩解鹽脅迫對植株的傷害，從而增強黃瓜幼苗對鹽脅迫的耐性（韓冰 等，2011）。李詠梅（2015）發現在鹽脅迫下，BBS（Bacillussp.AR156+Bacillussp.SM21+Serratiasp.XY21）家族各菌株或者菌株合劑的菌體對黃瓜生長都有一定的促進作用。李華山等（2017）將農桿菌DF-2接種到黃瓜幼苗上，使其獲得了更高的耐鹽性。錢蘭華等（2019）研究表明屬于巨大芽孢桿菌的B7菌株顯著提高了黃瓜耐鹽促生能力，有一定的應用前景。韓澤宇（2019）通過將高效耐鹽菌株NX-3與黃瓜幼苗生長的優勢促生菌NX-48復配成菌液，有效提高了黃瓜幼苗的耐鹽性，促進其生長發育。

5 問題與展望

鹽脅迫嚴重影響黃瓜的生長發育，培育耐鹽品種是提高黃瓜耐鹽性最根本的方法。目前黃瓜已完成全基因組測序，對于黃瓜的耐鹽反應也已有較多不同層次的研究。同時，隨著科技的不斷進步，轉錄組、蛋白質組、代謝組等組學，以及cDNA芯片、EST文庫測序、高通量測序、CRISPR/Cas9等技術的不斷成熟，也為黃瓜耐鹽脅迫育種的研究提供了更為高效的理論和技術支持。黃瓜耐鹽脅迫育種研究工作今后需要聚焦以下方面。

①黃瓜耐鹽種質資源的鑒定和篩選。耐鹽種質資源的挖掘是黃瓜耐鹽脅迫育種的物質基礎，黃瓜種質資源豐富，但絕大部分并未經過耐鹽鑒定，不利于育種工作的開展。此外，準確、高效的黃瓜耐鹽性鑒定和篩選體系也尚未建立，導致部分品種在不同試驗中的評價結果存在差異。因此，應在廣泛收集國內外黃瓜種質資源的基礎上，進一步建立可靠高效的黃瓜耐鹽性鑒定體系，對種質資源進行各個生長時期的耐鹽性鑒定，挖掘耐鹽種質。

② 黃瓜成株期耐鹽性的研究。目前黃瓜耐鹽性研究主要集中在芽期和苗期，然而隨著設施生產的普及，人工催芽和基質育苗等措施可以有效避免黃瓜在芽期和苗期受到鹽脅迫的影響，但黃瓜成株期出現的鹽害問題則較難解決，亟待進一步研究。因此，以產量和品質為主要目標性狀，鑒定和篩選黃瓜成株期的耐鹽品種，對于培育高產、優質的黃瓜耐鹽新品種具有重要意義。

③黃瓜耐鹽相關基因的挖掘及黃瓜耐鹽機理的解析。目前已有研究表明黃瓜耐鹽性屬于多基因控制的數量性狀，但尚未克隆到相關耐鹽基因，黃瓜的耐鹽機理也未見報道。因此，通過數量性狀位點（QTL）定位和全基因組關聯分析（GWAS）等方法挖掘黃瓜耐鹽脅迫相關候選基因，并結合生物信息學和多組學分析黃瓜的耐鹽機理，將是黃瓜耐鹽研究的重點。

④ 基因工程在黃瓜耐鹽脅迫育種中的應用。通過轉基因和基因編輯等方式可以準確驗證黃瓜耐鹽相關基因的功能，同時可以通過對目的耐鹽基因的精準編輯來快速培養耐鹽新品種。轉基因和基因編輯等技術在黃瓜中已成功應用，但目前黃瓜耐鹽相關基因的轉化多集中于將外源耐鹽性基因導入黃瓜，基因敲除以及通過基因工程培育黃瓜耐鹽新品種的研究相對較少。加強基因工程在黃瓜耐鹽脅迫育種中的應用，可以極大地加快黃瓜耐鹽脅迫育種的進程，具有廣闊的發展前景。