人毛囊干細胞wnt10b信號通路激活作用研究

姜金豆，林 秀，陳容容，胡葵葵

（廣東省婦幼保健院醫學美容科，廣東 廣州，510000）

毛發移植術是目前治療各種原因所致的毛發缺損性疾病最為常用的手術方法，手術主要以枕部毛發為供區來源，但對于大面積突發且供區不足的患者，該技術的應用及效果受到了嚴重的影響。毛囊組織工程的研究為這些問題的解決帶來了希望，近年來毛囊細胞移植重建毛囊的相關研究取得了一定進展，已通過鼠源性和人源性毛囊細胞重建出新的毛囊，但經傳代培養后的部分毛囊細胞活性下降，難以獲得具有高活性的細胞，毛囊組織工程的種子細胞來源問題仍有待解決。毛囊干細胞的增殖、遷移及分化機制仍有待深入研究。毛囊干細胞在其所在微環境中的多種信號因子調節下完成自我更新及分化過程，其中wnt信號通路廣泛參與到了毛囊干細胞的增殖、遷移、分化以及凋亡過程，國內外相關領域的探索目前仍局限于轉基因動物實驗研究階段。既往動物研究資料表明，wnt信號通路通過不同配體、受體以及上下游信號通路的交互調節參與毛囊干細胞的增殖分化過程[1]。

本項研究中，我們將使用病毒轉染技術調節人毛囊干細胞中Wnt信號通路相關分子的表達，研究分析wnt10b及其相關信號通路對毛囊干細胞增殖和分化的影響。該研究結果對于毛發缺損的發病機制和毛發組織工程以及干細胞基因治療毛發缺損方面均有重要的理論和實際意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 組織來源

人毛發組織來源于整形外科毛發移植術殘余的枕部毛發組織及面部提升術切除毛發組織。

1.1.2 實驗試劑

細胞培養試劑：胎牛血清（Hyclone，SH30087.01），DMEM（Hyclone，SH30023.01B），青鏈霉素（Hyclone，SH30010），PBS磷酸鉀緩沖液（Hyclone，SH30256.01B），Annexin V-APC細胞凋亡檢測試劑盒（keygen，KGA106），cellTiter96AQ單溶液細胞增殖檢測試劑（Promega，G3582）。

1.2 方 法

1.2.1 人毛囊干細胞分離培養與鑒定

人頭部皮膚標本先由林格液潤洗，去除多余脂肪，顯微剪分離處于毛囊峽部和毛球上部之間的隆突區組織,其深度起始位距表皮約1 mm范圍，延伸深度約1.8 mm,將分離隆突區組織應用 10ng/ml 中性蛋白酶37℃下消化45分鐘后接種。接種所用培養板應用Matrigel包被。將隆突區毛囊組織直接接種于Matrigel包被的培養板中，在37℃、5% CO2飽和濕度的孵箱中培養。細胞遷出后待細胞融合達到60%～70%時，以0.25%胰酶37℃下振蕩消化5-10min，收集細胞以1:2比例傳代培養。觀察細胞的增殖能力及形態學特征。取傳代培養4周的人毛囊干細胞（hair follicle stem cell，HFSCs）細胞進行流式細胞學分析及克隆形成能力測定，鑒定毛囊干細胞表型及增殖潛能。

1.2.2 Wnt10b信號通路的激活

利用gateway克隆技術構建含Wnt10b基因的質粒pAV.EX1d‐WNT10B/ⅠRES/eGFP，應用腺病毒包裝后轉染人毛囊干細胞以激活Wnt通路，分析Wnt10b信號通路激活在人毛囊干細胞自我更新和分化調節過程的差異及交互作用。轉染后細胞行克隆形成實驗，細胞凋亡實驗，細胞周期實驗，細胞增殖活力測定。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 載體結構圖譜見圖1

圖1 pAV.EX1d-WNT10B/IRES/eGFP載體結構圖譜

2.2 病毒感染結果

應用Adwnt10b轉染人毛囊干細胞后培養結果。細胞轉移后應用 wnt10b病毒載體及空白載體轉染,圖2為48小時后GFP蛋白表達情況。病毒載體成功轉染并表達于人毛囊干細胞中。wnt10b轉染后細胞生長較為密集，圖中熒光視野可見較多轉染陽性的GFP表達細胞。

圖2 過表達wnt10b毛囊干細胞（×200）a.明視野和熒光視野重疊圖，b.明視野，c.熒光視野

2.3 MTS細胞增殖檢測

wnt10b過表達激活 wnt10b信號后，對毛囊干細胞的增殖具有一定的促進作用(圖3)。MTS細胞增殖實驗結果表明，在第六天時，wnt10b過表達細胞的增殖率與空白對照組細胞相比，增殖比率提高了約50.1%。

圖3 wnt10b信號通路激活后毛囊干細胞細胞生長抑制率變化曲線

2.4 平板克隆實驗

圖4 人毛囊干細胞空白對照組

圖5 人毛囊干細胞-GFP細胞株

圖6 人毛囊干細胞-wnt10b細胞株

圖7 人毛囊干細胞wnt10b基因過表達的克隆形成率（克隆形成率=克隆數÷接種細胞數×100%）。

圖8 人毛囊干細胞wnt10b基因過表達的細胞存活分數（存活分數=實驗組克隆形成率÷對照組克隆形成率×100%）。

2.5 細胞凋亡檢測

細胞凋亡檢測結果中wnt10b轉染組細胞總凋亡比率為4.96%，而單純細胞組及空白載體轉染組這一比率分別為7.91%及8%（圖9）。結果分析表明，wnt10b的過表達抑制了細胞凋亡過程，wnt通路的激活對毛囊干細胞有著一定的保護作用。

圖9 人毛囊干細胞wnt10b基因過表達的凋亡檢測總凋亡細胞比例

3 討論

Notch信號通路是一個復雜而又保守的分子信號網絡，其發生作用與細胞、組織類型以及與其他信號通路的相互作用有關。Nocht廣泛參與到了干細胞自我更新及多向分化調節過程中，Notch及其受體在表皮中有廣泛的表達，在表皮不同層細胞間的分化中起到了一種分子開關的作用。本研究主要針對Notch信號通路對毛囊干細胞增殖分化過程的調節作用進行深入探索，為毛囊組織工程中種子細胞的體外大規模擴增及分化方向的控制提供新的研究策略。

哺乳動物中存在四種Notch受體,即Notch1，Notch2，Notch3，Notch 4[1]。Notch信號通路中存在5中不同的配體，分屬兩種不同家族（Jagged-1及Jagged-2,Delta-樣配體Delta 1,Delta 3,Delta 4）[2]。完整皮膚及培養細胞中Notch信號可調節毛囊干細胞的增殖、定型及分化方向的選擇。Notch為一單次跨膜蛋白，通過與其配體結合或通過Notch受體在兩種酶（γ‐分泌酶及ADAM非金屬蛋白酶）順序作用下水解，Notch 胞內段片段（N1ICD）進入胞核，與 Rbpj結合形成轉錄激活復合物，從而激活下游相關靶基因的表達發揮信號調節作用。這一系列變化稱為經典Notch信號通路[2]。Demehri S等人的研究證實，Notch信號通路的作用在于阻止毛囊干細胞向表皮細胞方向遷移分化[3]。Notch信號在隆突區干細胞向表皮分化的過程中起阻滯作用。轉基因小鼠研究中，其毛囊形成表皮囊腫與Notch信號部分減少有關[4]。

Wnt/β‐catenin信號通路是與Notch通路產生交互作用的諸多調節信號之一，其在毛囊胚胎的發育及后天穩定性的維持中起重要作用[5]。動物實驗證實，Wnt/β‐catenin信號通路的激活可促進毛囊由靜止期向生長期轉化，Notch信號通路中諸多基因的表達均受β‐catenin蛋白的調節。經典的Wnt信號通路可誘導祖細胞中Notch配體Jagged1的表達。目前對Notch及其相關信號通路的調節作用的了解仍局限于轉基因動物的實驗研究階段，對人毛囊干細胞體外Notch信號通路研究國內外尚無相關報道。目前有關Notch信號通路在毛囊中的作用的相關研究，主要通過針對不同轉基因小鼠分析獲取。完整皮膚及培養細胞中Notch信號調節角質形成細胞增殖，定型及分化方向。Wnt信號是胚胎發育過程中毛囊形成的必須通路之一，而成體表皮中過度激活Wnt會導致毛囊形成表皮囊腫。表皮中多種Notch信號通路基因的表達受到β‐連環蛋白的調控。經典的Wnt信號通路可誘導祖細胞中Jagged1的表達。敲除Jagged1可以阻滯β‐連環蛋白的異常毛囊形成作用，而對β‐連環蛋白的促分化作用不發生影響[5]。

我們在實驗中通過Notch激活后（N1ICD過量表達），并未發生毛囊干細胞的異常增殖，可能與wnt通路中β‐連環蛋白共同作用促進毛囊分化成熟有關。實驗研究發現，Notch信號可通過p21介導作用抑制Wnt通路蛋白的表達，有文獻表明Notch胞內段與β‐連環蛋白相結合后可負性調控β‐連環蛋白的轉錄活性[3]。本項目研究中通過深入探索Notch及其相關信號通路的調節作用，以達到模擬毛囊干細胞體內信號通路微環境，于體外培養毛囊干細胞，通過調節Notch信號通路及其與上游Wnt通路的交互作用，使毛囊干細胞于體外快速增殖，從而達到使毛囊干細胞在體外穩定增殖分化的目的。目前已可以通過轉染Wnt10b重組基因激活小鼠毛囊由休止期向增殖期轉變。本研究通過體外對毛囊干細胞轉染Notch1胞內活性片段以達到激活Notch信號通路的作用，從而進一步調節毛囊干細胞增殖及分化過程。

我們的研究小組通過實驗發現，Notch1可上調細胞周期相關調節因子p21的表達，使處在正常增殖過程中的毛囊干細胞出現細胞周期停滯，并進一步發生終末分化。本研究通過系統性阻斷與激活人毛囊干細胞Notch信號通路，在國內外首次就人毛囊干細胞增殖分化過程中該通路的調節作用進行了較為深入的探索。應用N1ICD及wnt10b轉染人毛囊干細胞后，GFP蛋白表達情況分析表明兩種病毒載體均成功轉染并表達于人毛囊干細胞中。N1ICD的轉染對細胞的增殖產生了明顯的抑制作用，與N1ICD轉染組相比，wnt10b轉染后細胞生長較為密集。N1ICD過表達激活Notch信號后，對毛囊干細胞的增殖具有一定的抑制作用。MTS細胞增殖實驗結果表明，N1ICD對細胞增殖的抑制率約為35.83%，而與之相反的是，通過wnt10b過表達激活Wnt通路后，細胞增殖比率提高了約46.8%。N1ICD與wnt10b處理組克隆形成率測定結果分別為44%±0.08及67%±0.09,統計學差異明顯（p<0.05）。通過流式細胞儀檢測結果分析，N1ICD與wnt10b兩種不同信號通路的關鍵蛋白過表達后，毛囊干細胞S期差異明顯，其中N1ICD過表達處理組S期比率僅為7%，wnt10b處理組為39.92%，空白載體對照組及單純細胞組這一比例分別為40.9及33.17%，Notch信號激活所導致的細胞周期改變與對照組相比具有較明顯的統計學差異，結果表明Notch信號通路可能使部分細胞退出正常的細胞周期，導致部分細胞無法進入S期而停留于G1，從而抑制毛囊干細胞的正常增殖過程。兩種不同信號通路激活所導致的細胞功能改變，來源于通路相關的不同靶基因表達的調節作用。Western blot 蛋白水平檢測結果表明，N1ICD轉染后N1ICD及Notch信號下游Hes1 蛋白表達明顯上調，表明Notch信號成功激活，N1ICD組細胞周期抑制因子p21表達上調，wnt10b蛋白含量明顯減少，與wnt10b處理組相比，相關蛋白的表達具有相反的調節作用。

研究發現Notch信號通路對經典的wnt通路中wnt10b蛋白的表達具有一定的抑制作用，N1ICD過表達激活Notch信號通路后，通過細胞周期抑制蛋白p21表達的上調使人毛囊干細胞發生細胞周期阻滯，退出正常的細胞周期循環，退出細胞周期循環的人毛囊干細胞并未發生大規模凋亡，而是進入到了分化過程中。Notch1信號的阻斷導致了Wnt/β‐catenin信號通路中wnt10b的上調,使人毛囊細胞中β‐鈣連環蛋白介導信號的增強，而Wnt信號可被激活的Notch1表達所抑制。Notch1激活導致的wnt通路抑制作用可能由p21介導。Notch激活p21表達，進而反饋性下調wnt10b基因的表達。

4 結論

通過慢轉錄病毒轉染的方式使人毛囊干細胞Notch胞內活性片段N1ICD過表達，可成功激活Notch信號通路。Notch信號通路與經典的wnt信號通路在就人毛囊干細胞細胞周期的調節中有著完全相反的作用，這種調節作用可能與細胞周期調節蛋白p21的表達密切相關。Notch信號激活后可使人毛囊干細胞出現細胞周期停滯，一定程度上抑制了細胞的增殖，但并未導致人毛囊干細胞的大規模凋亡，可能使大批人毛囊干細胞進入進一步的分化過程中。這一新的研究發現為人毛囊干細胞體外擴增培養過程中細胞增殖及分化的可控性提供了新的研究策略。