顳葉癲癇患者外周血非離子通道基因甲基化水平觀察

陶華，周煦，陳增強(qiáng)，吳健豪，李克深

1 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東湛江524001；2 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心

離子通道基因是神經(jīng)興奮性調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳遞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其功能異常曾被歸類為離子通道疾病，在癲癇病理機(jī)制研究中一直備受關(guān)注［1］。隨著遺傳因素研究的廣泛開展，許多癲癇致病基因被鑒定出來，但僅有約1/4 的基因?yàn)殡x子通道基因［2］，提示非離子通道基因在癲癇發(fā)病中可能發(fā)揮著更加廣泛的作用。DNA 甲基化是表觀遺傳的主要形式之一，基因啟動(dòng)子及其鄰近外顯子區(qū)域甲基化程度異常增高可導(dǎo)致相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄沉默，反之則表現(xiàn)為基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，均可影響下游通路的生物學(xué)功能［3-5］。此外，DNA 甲基化可受到后天環(huán)境修飾，并將其遺傳給后代，故DNA 甲基化在遺傳和環(huán)境的交互影響中，相較于傳統(tǒng)的單核苷酸多態(tài)性和新生突變，可能發(fā)揮更為廣泛的作用［6-7］。廣州醫(yī)科大學(xué)廖衛(wèi)平團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)總結(jié)了癲癇性腦病的致病基因［8］。2013 年 2 月—2018 年 8 月，本研究觀察了顳葉癲癇患者外周血非離子通道基因甲基化水平，評(píng)估這些基因在顳葉癲癇患者中是否受到表觀遺傳調(diào)控，為癲癇診治提供新的線索。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇顳葉癲癇患者38 例納入病例組，選擇同期體檢正常的志愿者38例為對(duì)照組。病例組男18例、女20例，年齡（32.1± 14.4）歲，發(fā)病年齡（23.3±16.2）歲，病程（8.8±9.8）年，基于國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟2010年倡議評(píng)估藥物反應(yīng)敏感24例、耐藥14 例。對(duì)照組男 19 例、女 19 例，年齡（33.4 ± 6.4）歲，兩組性別和年齡資料具有可比性。本研究獲廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象已獲得知情同意。

1.2 外周血非離子通道基因甲基化檢測(cè) 采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化結(jié)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)。首先評(píng)估非離子通道基因，即錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白11（ANKRD11）、動(dòng)力蛋白（DNM1）、類動(dòng)力蛋白 1（DNM1L）、人成纖維生長(zhǎng)因子12（FGF12）、G 蛋白α亞基 O1（GNAO1）、血影蛋白 α 鏈非紅細(xì)胞 1（SP?TAN1）、突觸融合蛋白結(jié)合蛋白1（STXBP1）和突觸RasGTP 酶激活蛋白1（SYNGAP1）的啟動(dòng)子區(qū)及其鄰近第一外顯子區(qū)（?2~1 kb）是否存在CpG 島。具體參數(shù)：長(zhǎng)度>200 bp，C+G 比例>50%，觀察/預(yù)測(cè)比值>0.60。參考Homo sapiens build CBI37/hg19，獲取CpG 島所在區(qū)域的DNA 序列，分別設(shè)計(jì)特異性引物，挑選能夠在同一體系多重?cái)U(kuò)增重亞硫酸鹽處理后的17 個(gè)目的片段，優(yōu)化各個(gè)引物在同一體系的配置濃度。取外周血1 mL，提取DNA，然后用EZ DNA Methylation-Gold kit 試劑將未甲基化的堿基C 轉(zhuǎn)化為U。以處理后的DNA 為模板，利用Hot?StarTaq polymerase kit 和提前優(yōu)化的特異性引物混合物，擴(kuò)增目的片段。用帶有Index 序列的引物，通過PCR 擴(kuò)增向文庫(kù)末端引入和illumina 平臺(tái)兼容的特異性標(biāo)簽序列，反應(yīng)共11 個(gè)循環(huán)。獲得測(cè)序文庫(kù)后，于 Ilumina Hiseq 平臺(tái)以 2×150 bp 的雙端測(cè)序模式進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得FastQ 數(shù)據(jù)。經(jīng)質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)處理后，獲得等位基因C 和等位基因C+U的讀數(shù)，兩者的比值×100%，即為非離子通道基因甲基化率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。通過Logistic 回歸分析，校正性別和年齡后，分析FGF12基因甲基化率與顳葉癲癇的相關(guān)性。多重檢驗(yàn)的假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)通過Bonferroni correction 校正。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組非離子通道基因甲基化率比較 病例組外周血FGF12 基因甲基化率低于對(duì)照組（P<0.05）。詳見表1。校正性別和年齡后，F(xiàn)GF12 基因甲基化率仍與顳葉癲癇顯著相關(guān)。詳見表2。

表1 兩組外周血非離子通道基因甲基化率比較（%，）

表1 兩組外周血非離子通道基因甲基化率比較（%，）

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

組別病例組對(duì)照組SYNGAP1 0.76±0.22 0.74±0.16 n 38 38 ANKRD11 0.75±0.03 0.75±0.04 DNM1 0.81±0.10 0.83±0.11 DNM1L 14.28±0.94 14.27±0.41 FGF12 2.84±0.55*4.09±1.35 GNAO1 2.27±0.63 2.31±0.57 SPTAN1 0.99±0.06 1.01±0.05 STXBP1 1.00±0.25 1.10±0.20

表2 顳葉癲癇影響因素的Logistic回歸分析結(jié)果

2.2 FGF12 基因甲基化率與顳葉癲癇臨床參數(shù)的關(guān)系 低齡（<26 歲）顳葉癲癇患者FGF12 基因甲基化率低于高齡（≥26歲）患者，P<0.05。詳見表3。

表3 FGF12基因甲基化率與顳葉癲癇臨床參數(shù)的關(guān)系（%，）

表3 FGF12基因甲基化率與顳葉癲癇臨床參數(shù)的關(guān)系（%，）

臨床參數(shù)性別n FGF12基因甲基化率OR P男 女18 20 2.79±0.46 2.87±0.63 0.960.579 5年齡低齡（<26歲）高齡（≥26歲）發(fā)病年齡早發(fā)（<18歲）遲發(fā)（≥18歲）病程短程（<5歲）長(zhǎng)程（≥5歲）藥物反應(yīng)敏感耐藥19 19 2.56±0.35 3.09±0.59 0.830.001 9 19 19 2.74±0.37 2.93±0.67 0.940.303 5 19 19 2.77±0.63 2.90±0.48 0.950.468 0 24 14 2.82±0.43 2.85±0.66 0.990.871 9

3 討論

顳葉癲癇是局灶性癲癇的最常見類型，也是耐藥性癲癇的主要因素。數(shù)十年來，新型抗癲癇藥物被陸續(xù)應(yīng)用于臨床，但是約30%癲癇患者始終無法得到有效控制，提示顳葉癲癇的病理機(jī)制研究有待新突破［9］。本研究基于表觀遺傳學(xué)，首次發(fā)現(xiàn)FGF12 基因甲基化率在顳葉癲癇人群中相對(duì)較低，且在后續(xù)的亞組分析中發(fā)現(xiàn)，其甲基化率在低齡顳葉癲癇患者中相對(duì)較低，提示FGF12 基因在顳葉癲癇發(fā)病過程中，很可能受到表觀遺傳調(diào)控。

FGF 家族與細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞活性密切相關(guān)，廣泛參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)、器官形成、組織修復(fù)、腫瘤生長(zhǎng)和浸潤(rùn)等［10］。FGF12 是其家族成員之一，可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與位于胞外的快鈉離子通道C 末端相互作用，參與調(diào)控電壓依賴性快鈉離子通道的失活周期［11-12］。FGF12 與絕大多數(shù)成員相比，其缺乏N 末端序列，但是具有核定位信號(hào)的殘基。將FGF12 基因轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，可見其主要聚集于細(xì)胞核，提示其很可能在細(xì)胞核內(nèi)也發(fā)揮調(diào)控作用。研究顯示，F(xiàn)GF12 主要在心臟和腦組織中表達(dá)，提示該基因和心腦功能密切相關(guān)［13］。FGF12功能異常，在心臟主要見于特發(fā)性室性心動(dòng)過速［14］，在腦內(nèi)主要見于癲癇［15］。

目前多項(xiàng)研究認(rèn)為FGF12 基因和癲癇表型密切相關(guān)。ODA 等［15］發(fā)現(xiàn)，West 綜合征患者第 3 染色體和第9染色體異常分布，臨床上表現(xiàn)為嚴(yán)重癲癇、發(fā)育遲緩和骨骼肌異常等，拷貝數(shù)檢測(cè)可見覆蓋FGF12 基因的3q28q29 拷貝數(shù)增加。SIEKIERSKA等［12］報(bào)道，F(xiàn)GF12 基因外顯子區(qū)功能獲得的錯(cuò)義突變［NM_021032.4：c. 341G>A：p.（Arg114His）］在早發(fā)性癲癇伴腦萎縮患者中反復(fù)出現(xiàn)。上述兩類遺傳變異提示，F(xiàn)GF12 基因過度表達(dá)可能影響電壓門控鈉離子通道的活性，導(dǎo)致癲癇發(fā)作閾值下降。

考慮到基因新生突變是早發(fā)性癲癇性腦病的重要遺傳基礎(chǔ)，GUELLA 等［10］通過對(duì) 2 例早發(fā)性癲癇患者進(jìn)行外顯子測(cè)序，證實(shí)FGF12基因新生突變（c.G155A，p.R52H）和早發(fā)性癲癇相關(guān)，但并未表現(xiàn)出既往報(bào)道中的進(jìn)展性和早死性特征，提示除了該新生突變，尚有其他潛在機(jī)制參與其中。我們發(fā)現(xiàn)FGF12 基因甲基化率在顳葉癲癇人群中相對(duì)較低，而且亞組分析提示其在低齡患者中相對(duì)更低，提示甲基化水平降低可能導(dǎo)致FGF12 在腦內(nèi)表達(dá)異常上調(diào)，且年齡對(duì)甲基化水平的影響可以在一定程度解釋FGF12新生突變表型的不完全一致性。

通過分子遺傳研究篩選癲癇致病基因，對(duì)癲癇的病因診斷、綜合征分型以及新藥物靶點(diǎn)開發(fā)和精準(zhǔn)化治療都具有重要意義［16］。近年來表觀遺傳現(xiàn)象受到越來越多的關(guān)注［17］。對(duì)于哺乳動(dòng)物，基因啟動(dòng)子及其鄰近外顯子區(qū)域常?？梢奀pG 島，是表觀遺傳調(diào)控的重要靶點(diǎn)［18］。DNA 甲基化是指在 CpG 島中，胞嘧啶第5位碳原子獲得一個(gè)甲基化殘基后，形成甲基化的CpG 島，通過抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，反之促進(jìn)基因功能增強(qiáng)，影響下游生物學(xué)功能［19］。DNA 甲基化和去甲基化在生長(zhǎng)發(fā)育階段可以動(dòng)態(tài)改變，以適應(yīng)基因表達(dá)和沉默的功能需要，具有時(shí)間特異性［20］。此外，DNA 甲基化在一定程度上存在細(xì)胞和組織特異性［21］。本研究只針對(duì)外周血液基因組，因缺乏腦組織樣本，上述結(jié)果無法在腦組織樣本中驗(yàn)證，這是本研究的局限性之一。除此之外，本研究為小樣本、單中心研究，雖然經(jīng)過Bonferri correction 校正降低假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)，但是研究結(jié)果是否具有跨越地區(qū)、國(guó)別和人種的廣泛適用性尚待驗(yàn)證。