宮頸鱗癌組織中HIF-1α、YAP、TAZ蛋白表達變化及意義

馮倩倩，阿孜爾古麗·阿布都克日木，努爾比亞木·買買提依明，陳曉琳，斯依提阿吉·麥麥提明，史娟，馬紅

1 新疆醫科大學基礎醫學院病理教研室，烏魯木齊830054；2 新疆醫科大學基礎醫學院病原微生物教研室

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一。我國宮頸癌病死率整體呈上升趨勢［1-2］。從宮頸上皮內瘤變（CIN）到宮頸癌的發生，是多步驟、多基因參與的長期復雜過程，侵襲和轉移是導致宮頸癌預后差的主要原因。因此，探討宮頸癌侵襲、轉移的分子機制，尋找早期診斷和預后評估指標是宮頸癌研究中亟待解決的重大問題。缺氧誘導因子1α（HIF-1α）是維持細胞內氧代謝平衡的重要調控因子，其表達或活性增加與人類多種腫瘤的發生、發展密切相關［3］。研究發現，HIF-1α 激活 Hippo 信號通路，通過上皮－間質轉化（EMT）、血管生成等促進腫瘤侵襲轉移［4］。Yes 激酶相關蛋白（YAP）和PDZ 結合模序的轉錄共激活因子（TAZ）是Hippo 下游通路的兩個關鍵轉錄共激活因子［5］。本課題組前期研究發 現 ，宮 頸 癌 siha、C33A 細 胞 中 HIF-1α、YAP、TAZ mRNA 表達增強，慢病毒干擾HIF-1α 表達后可抑制siha、C33A 細胞侵襲，并促進腫瘤細胞凋亡。本研究觀察了 CSCC 組織中HIF-1α、YAP、TAZ 的表達變化及其相互關系，旨在探討三者與宮頸癌發生發展的關系及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 組織來源 收集醫院病理科2016 年1 月—2019 年7 月存檔的石蠟包埋組織。CSCC 組織40例，癌旁正常宮頸組織30 例。患者年齡31~83 歲，所有患者術前均無放療、化療及免疫治療史，高分化19 例、中低分化21 例，有淋巴結轉移15 例、無淋巴結轉移 25 例。CIN 組織 58 例（CIN I 級 32 例、Ⅱ~Ⅲ級26例），患者年齡28~78歲。

1.2 HIF-1α、YAP、TAZ 檢測 采用免疫組化 SP 法檢測CSCC 組織、CIN 組織及癌旁正常宮頸組織中的HIF-1α、YAP、TAZ 蛋白。兔抗人HIF-1α、YAP、TAZ多克隆抗體購自英國Abcam 公司。SP 免疫組化試劑盒和DAB 顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。石蠟包埋組織進行連續3 μm厚切片，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后微波爐抗原修復，滴加3%H2O220 μL阻斷內源性過氧化物酶，然后滴加一抗4 ℃冰箱培育過夜。HIF-1α、YAP、TAZ 抗體的工作液濃度分別為1∶100、1∶150 和1∶200。次日滴加生物素標記的二抗，37 ℃孵育30 min。各步驟間隔均用 PBS 緩沖液（pH 7.4）沖洗 3 遍（10 min）。DAB 顯色，蘇木精對比染色，常規乙醇逆濃度梯度脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。每批染色均以上述抗體已知陽性的切片作陽性對照，以0.01 mol/L的PBS 代替一抗作陰性對照。HIF-1α 蛋白表達產物位于細胞核，YAP 和TAZ 蛋白表達產物位于細胞質或細胞核，細胞內有棕黃色顆粒者為陽性表達。隨機每張切片取10 個高倍視野（200×）觀察陽性細胞，計算陽性細胞百分比，陽性細胞百分比≥25%判定為蛋白表達陽性，細胞無染色或陽性細胞百分比<25%判定為陰性。

1.3 統計學方法 采用SPSS18.0 統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson 相關分析法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CSCC 組織、CIN 組織及癌旁正常宮頸組織中 HIF-1α、YAP 和 TAZ 蛋白表達比較 CSCC、CIN 組織中 HIF-1α、YAP、TAZ 蛋白陽性表達率高于癌旁正常宮頸組織（P均<0.05）。中低分化的CSCC 組織中YAP 蛋白陽性表達率高于高分化組織；有淋巴結轉移的CSCC 組織中TAZ 蛋白陽性表達率高于無淋巴結轉移組織（P均<0.05）。詳見圖1、表1。

圖1 CSCC組織、CIN組織及癌旁正常宮頸組織中HIF-1α、YAP和TAZ蛋白表達情況（免疫組化SP法）

表1 CSCC組織、CIN組織及癌旁正常宮頸組織中HIF-1α、YAP和TAZ蛋白表達比較［例（%）］

2.2 CSCC組織中HIF-1α、YAP、TAZ蛋白表達的相關性 40 例 CSCC 組織中，HIF-1α 與 YAP 蛋白均陽性表達 23 例、均陰性表達 8 例、HIF-1α 蛋白陽性且YAP 蛋白陰性 3 例、HIF-1α 蛋白陰性且 YAP 蛋白陽性6例，HIF-1α與YAP蛋白表達呈正相關（r=0.487，P<0.05）；HIF-1α 與 TAZ 蛋白均陽性表達 20 例、均陰性表達 7 例、HIF-1α 蛋白陽性且 TAZ 蛋白陰性 6例、HIF-1α 蛋白陰性且 TAZ 蛋白陽性 7 例，HIF-1α與TAZ 蛋白表達無相關性（r=0.274，P>0.05）；YAP及TAZ蛋白均陽性表達21例、均陰性表達5例、YAP蛋白陽性且TAZ 蛋白陰性8 例、YAP 蛋白陰性且TAZ 蛋白陽性 6 例，YAP 與 TAZ 蛋白表達無相關性（r=0.170，P>0.05）。

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性生命健康［1］。宮頸癌在發展中國家的發病率和病死率遠高于發達國家［2］。缺氧是大多數實體腫瘤的共同特征。HIF-1α 的表達和活性受氧濃度的精密調節，是細胞適應缺氧微環境的關鍵轉錄因子，其表達增加可增強腫瘤糖酵解、細胞增殖、腫瘤血管生成和EMT，在腫瘤的生長、侵襲和轉移中發揮重要作用［6］。JAN 等［7］通過移植小鼠模型研究顯示，在腺苷酸激酶4過表達激活HIF-1α，進一步誘導EMT，促進肺癌浸潤和轉移。COWMAN 等［8］在腎透明細胞癌中也發現，HIF-1α 在腫瘤細胞中高表達，與高腫瘤高分級和轉移顯著相關，與總生存率降低獨立相關。本研究結果顯示，與癌旁正常宮頸組織相比，HIF-1α 蛋 白在 CIN、CSCC 組織中表達升高，與YANG 等［9］研究結果一致。盡管 HIF-1α 蛋白在CINⅠ級和CIN Ⅱ~Ⅲ級的表達差異無顯著性，但總體呈上升趨勢，提示從CIN 向腫瘤轉化過程中，異型細胞增生活躍，缺氧微環境刺激下HIF-1α 表達升高，參與 CSCC 的發生發展。YAN 等［10］亦發現宮頸癌組織中HIF-1α 表達越高，預后越差。本研究發現CSCC 組織中HIF-1α 表達與分化程度、淋巴結轉移均無關，與相關研究結果一致［11］，但隨著分化程度降低、淋巴結轉移其表達呈上升趨勢，提示HIF-1α 蛋白表達增強可能與預后不良有關。

Hippo 通路是近年來新發現的抑癌通路，通過激酶級聯反應發揮負性調控作用。Hippo 通路失活參與了腫瘤的發生［12］。最近研究強調了Hippo 通路在控制腫瘤生長、保持細胞增殖與凋亡平衡及信號轉導失調方面的作用，其核心效應因子YAP/TAZ的過度激活可導致細胞生長失控和惡性轉化［13］。TOTARO 等［14］發 現 Hippo 信 號 通 路 的 失 活 可 使YAP/TAZ 過表達。HE 等［15］研究顯示，YAP 在宮頸上皮細胞中的過度激活可誘導HPV 受體表達，破壞宿主細胞天然免疫，YAP 差異激活和表達決定了個體對HPV 的易感性。在乳腺癌細胞中，HIF-1α 和TAZ 相互作用，HIF-1α 增加 TAZ 的合成和核定位來刺激TAZ 表達和活性，抑制TAZ 表達會影響HIF-1α靶 基 因 的 低 氧 誘 導［16］。 CHOI 等［17］研 究 顯 示 ，YAP/TAZ 的激活啟動了胃癌的發病并導致下游MYC 表達上調，從而促進胃癌的侵襲和轉移。本研究結果顯示，YAP、TAZ 蛋白在 CIN、CSCC 組織中陽性表達率高于癌旁正常組織，并與CSCC 分化程度和淋巴結轉移有關；進一步發現，YAP、TAZ 蛋白在CIN Ⅱ~Ⅲ級組織中的表達高于CIN Ⅰ級組織，提示CSCC的發生發展可能與YAP、TAZ過表達有關。

近年來研究表明，腫瘤細胞中YAP、TAZ表達受HIF-1α 的調節，通過EMT、血管生成等促進腫瘤侵襲轉移［18］。LIN等［19］發現在乳腺癌細胞中HIF-1α可異常激活 YAP/TAZ，而 RASFF、MER 表達缺失，促進乳腺癌細胞增殖和轉移。ZINATIZADEH 等［20］發現，低氧條件下 HIF-1α 對 YAP、TAZ 的調節方向和機制不同，在腫瘤細胞中HIF-1α 上調TAZ 表達，降低YAP 和磷酸化蛋白（S127）表達，通過激活ERK/MAPK 通路促進腫瘤細胞增殖。本研究結果也顯示，CSCC 組織中HIF-1α與YAP蛋白表達呈正相關，因此推測HIF-1α可能通過激活YAP表達促進CSCC的發生發展。而HIF-1α 和TAZ 的關系還需增加樣本量進一步論證。

綜上所述，HIF-1α、YAP、TAZ蛋白在CIN、CSCC組織中陽性表達率高于癌旁正常宮頸組織，且YAP、TAZ表達與CSCC 分化程度、淋巴結轉移相關，提示HIF-1α、YAP、TAZ 可能在 CIN 惡性轉化、CSCC的侵襲轉移中起著重要作用，有望成為CSCC 治療的潛在靶點。本研究結果為進一步深入相關研究奠定了基礎。