circLMNB1對結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡、細胞周期的影響及機制探討

何春萍，黃超，周瑞，于紅剛，吳鵬波

武漢大學人民醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢430060

結(jié)直腸癌（CRC）引起的死亡是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，每年約有140 萬人被確診為結(jié)直腸癌［1］。CRC 是一種多因素疾病，發(fā)病機制很復雜。研究表明，遺傳和表觀遺傳學改變都參與CRC 的發(fā)生和發(fā)展［2］。雖然近年來內(nèi)鏡手術(shù)已被廣泛用于CRC 的臨床治療，但由于肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高（約50%），患者預后仍然很差［1］。CRC患者的預后、5年生存率與確診時的分期密切相關(guān)［3］。目前結(jié)腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機制尚不十分明確，深入探索CRC 發(fā)生發(fā)展的分子機制，發(fā)現(xiàn)新的診斷標志物有助于早期治療。環(huán)狀RNA（circRNA）通過形成連續(xù)環(huán)而具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)特征［4］。由于circRNA 中沒有游離的5'-/3'-突出端，因此它們對核酸外切酶介導的切割具有抗性［5］。研究表明，circRNA 廣泛參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展［6］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，circLMNB1在結(jié)直腸癌中表達上調(diào)，具有促進結(jié)直腸癌細胞遷移、侵襲的能力，但未涉及circLMNB1 對結(jié)直腸癌細胞增殖和凋亡的調(diào)控作用。2020 年3 月—2021 年4月，本研究采用siRNA 介導技術(shù)對circLMNB1 表達進行敲降，觀察其對結(jié)直腸癌細胞系HCT116 增殖、凋亡、細胞周期的影響，并探索circLMNB1是否通過干預miR-143調(diào)控腫瘤細胞惡性行為。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 結(jié)直腸癌細胞系HCT116均購于中科院細胞庫。circLMNB1 siRNA由蘇州吉瑪生物設(shè)計并合成。SYBR green 購于ABI公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自DBI BioscieVectore公司。細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)RPMI1640 購自Gibco 公司。血清購于Biological Industries公司。青鏈霉素購自碧云天生物技術(shù)有限公司。胰蛋白酶購自Sigma 公司。細胞凋亡流式檢測試劑盒、細胞周期流式檢測試劑盒、CCK-8 試劑盒均購自聯(lián)科生物。Lipofectamine3000 試劑購自英濰捷基公司。蛋白定量試劑盒BCA試劑盒購自賽默飛公司。TRIzol試劑購于寶生物工程（大連）有限公司。Bax（A00183）、Caspase-3（BA2142）和GAPDH（A00227）一抗購自博士德生物公司。HRP標記的山羊抗兔（ab6721）二抗購自Abcam公司。

1.2 細胞分組及轉(zhuǎn)染 將HCT116 細胞分為空白組、對照組、實驗組，空白組正常培養(yǎng)，對照組和實驗組分別轉(zhuǎn)染NC siRNA、circLMNB1 siRNA，加入胎牛血清，培養(yǎng)24 h，吸棄舊培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以備后續(xù)檢測。采用qRT-PCR法檢測各組細胞中的circLMNB1。circLMNB1上游引物序列為5'-GC?CAAAATTGAATGCTGTCC-3'，下游引物序列為5'-TGAGATAGCCCAGCAATCCT-3'；內(nèi)參 GAPDH 上游上游引物序列為5'-CCAGCCGAGCCACATCGCTC-3'，下游引物序列為5'-ATGAGCCCCAGCCTTCTC?CAT-3'。以 2?ΔΔCt表示 circLMNB1 相對表達量。實驗組、對照組、空白組細胞中circLMNB1相對表達量分別為0.17±0.23、0.83±0.16、0.72±0.08，實驗組低于對照組和空白組（P均<0.05），說明circLMNB1 siRNA轉(zhuǎn)染成功。

1.3 細胞增殖能力檢測 將三組細胞消化成細胞懸液，以 4×103/孔種于 96 孔板中，每組設(shè)置 3 個復孔，置于細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，向其中加入10 μL CCK-8 工作液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育2 h，最后收集上清，檢測450 nm 處光密度值，表示細胞增殖能力。

1.4 細胞凋亡情況檢測 三組細胞培養(yǎng)48 h，吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，加入預溫PBS 洗滌板內(nèi)細胞2次后，加入胰蛋白酶消化細胞，制備單細胞懸液，隨后將細胞移入流式管，加入AnnexinV/PI 染色工作液，避光孵育15 min 后，上流式細胞儀檢測。以An?nexinV+PI?和AnnexinV+PI+兩個象限的細胞百分率之和表示細胞凋亡水平。采用Western blotting 法檢測各組細胞中的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax：收集兩組5×106個細胞，加入RIPA 裂解液于冰上裂解細胞30 min，提取總蛋白；使用BCA 蛋白檢測試劑盒對總蛋白溶液進行定量；配置 PAGE 膠，將 20 μg 蛋白加入上樣孔中進行電泳；將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，使用5%脫脂奶粉進行封閉，加入封閉液稀釋的一抗，4 ℃下過夜；膜繼續(xù)經(jīng)洗滌、二抗孵育和洗滌后，使用化學發(fā)光劑對膜進行發(fā)光、顯影液顯影和定影液定影；使用Imag J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參條帶灰度值之比表示目的蛋白相對表達量。

1.5 細胞周期檢測 收集各組細胞，PBS 洗滌后，使用胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液。在懸液中加入無水乙醇，4 ℃固定過夜后，離心并棄去上清，加入PI 染液染色，吹打均勻后，避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測。

1.6 細胞中miR-143檢測 采用qPCR 法檢測實驗組、對照組、空白組中的miR-143，以U6 為內(nèi)參。miR-143 上游引物序列為5'-TGAGGTGCAGT?GCTGCTGCATC-3'，下游引物序列為 5'-GCTA?CAGTGCTTCATCTCAGACTC-3'；U6 上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。以 2?ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

1.7 circLMNB1與miR-143相互作用驗證 通過序列比對，尋找circLMNB1 與miR-143 的結(jié)合位點；將包括該位點的circLMNB1 片段序列（300 bp）插入psi-CHECK2 載體中（circLMNB1 WT）；并對該位點進行點突變后，構(gòu)建突變體（circLMNB1 MUT）。將 miR-143 mimic 或 NC mimic 與 psi-CHECK2 載 體共轉(zhuǎn)染HCT116細胞，進行雙熒光素酶檢測。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗；多組比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖能力、凋亡水平、細胞周期比較 實驗組增殖能力、S 期細胞比例高于對照組，凋亡水平、Bax 蛋白、Caspase-3 蛋白相對表達量及G1期細胞比例低于對照組和空白組（P均<0.05）。見表1。

表1 實驗組、對照組、空白組細胞增殖能力、凋亡水平、細胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達比較（）

表1 實驗組、對照組、空白組細胞增殖能力、凋亡水平、細胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達比較（）

注：與對照組和空白組相比，*P<0.05。

組別S Bax 0.23±0.03*1.18±0.02 1.24±0.05實驗組對照組空白組Caspase-3 0.22±0.03*1.28±0.03 1.32±0.04增殖能力0.92±0.04*0.71±0.02 0.77±0.03凋亡率（%）2.80±0.36*6.03±0.25 5.86±0.30細胞周期（%）G1 46.09±0.79*51.92±1.50 51.94±2.29 43.60±0.57*36.16±1.07 36.30±1.65

2.2 各組細胞中miR-143 表達比較 實驗組、對照組、空白組細胞中miR-143相對表達量分別為1.34±0.19、0.52 ± 0.08、0.67 ± 0.25，實驗組 miR-143 表達高于對照組和空白組（P均<0.05）。

2.3 circLMNB1與miR-143的相互作用 circLMNB1與miR-143 存在互補配對的序列。將含有這段結(jié)合序列的片段插入psi-check2 載體中，并進行點突變。野生型和突變型結(jié)合位點見圖1A。circLMNB1與miR-143 結(jié)合序列見圖1B。miR-143 mimics WT組及miR-143 mimics MUT 組miR-143 相對表達量分別為3.11± 0.54、10.6± 0.97，NC WT 組及NC MUT組miR-143相對表達量分別為10.74±1.89、11.37±1.51，miR-143 mimics MUT 組 miR-143 相對表達量高于miR-143 mimics WT組（P<0.05）。

圖1 circLMNB1與miR-143相互作用驗證

3 討論

miRNAs 是一類短的單鏈非編碼RNA 分子，可通過與 mRNA 的編碼區(qū)、3' UTR 或 5' UTR 結(jié)合，實現(xiàn)對靶點mRNA 的降解或轉(zhuǎn)錄抑制作用［7］。研究表明，miRNAs 廣泛存在于血清、血漿或其他體液中［8］，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［9］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-143可抑制乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移［10］；miR-143 表達水平與卵巢癌的進展呈負相關(guān)，且體外實驗顯示其能夠抑制卵巢癌惡性生物學行為［11］。除此之外，miR-143在其他腫瘤中，均顯示出抑制腫瘤發(fā)生或轉(zhuǎn)移的作用［12-14］。最新研究表明，miR-143-3p 在結(jié)直腸癌中起到抑癌作用［15］，miR-143-3p 可作為潛在的非侵襲性結(jié)直腸癌的標志物［16］。一項體外實驗顯示，miR-143 可參與結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡和周期分布的改變［17］。研究結(jié)果顯示，與正常鄰近組織相比，結(jié)直腸癌組織中miR-143 表達水平顯著下調(diào)；而將人工合成的miR-143 mimics 轉(zhuǎn)染到結(jié)直腸癌細胞系SW-480 細胞后，細胞增殖水平呈顯著下降趨勢，而凋亡水平則顯著增加；而且，轉(zhuǎn)染miR-143 mimics 后，結(jié)直腸癌細胞中S 期細胞比例減少、G1期細胞比例增加。miR-143 在結(jié)直腸癌中表達水平的改變及其對結(jié)直腸癌細胞惡性生物學行為的影響表明，miR-143可作為結(jié)直腸癌診斷和治療的新靶點。

circRNA 是一類pre-mRNA 經(jīng)反向剪接而產(chǎn)生的非編碼轉(zhuǎn)錄本，不具有5'端帽和3'端尾的特征，剪接位點通過共價結(jié)合形成閉環(huán)［18］。目前，circRNA作為競爭性內(nèi)源RNA 影響下游miRNA 進而調(diào)控腫瘤相關(guān)基因表達機制是當前腫瘤研究的主流方向［19］。circRNA 已被證實廣泛參與腫瘤發(fā)生發(fā)展調(diào)控［20-21］。 ZHANG 等［22］發(fā)現(xiàn)，circ-PIP5K1A 通過調(diào)控miR-1273a 促進結(jié)直腸癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。在宮頸癌的進展過程中，has_circ_0000515 通過上調(diào)ELK1表達，使腫瘤朝惡化方向發(fā)展［23］。最新的一項研究顯示，has_circ_0001806 在結(jié)直腸癌中可靶向吸附 miR-193-5p，進 而 調(diào) 控 下 游 COL1A1 表達［24］。 has_circ_001971 在 結(jié) 直 腸 癌 中 則 可 干預miR-29c-3p 表達，調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移及血管形成［25］。ZHANG 等［26］最新研究顯示，受circ-ACAP2 調(diào)控的miR-143 在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。circ-ACAP2過表達可促進結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲和放射抗性，同時抑制細胞凋亡。數(shù)據(jù)庫資料顯示，miR-143-3p 是結(jié)直腸癌細胞中circ-ACAP2 的直接靶點。circ-ACAP2 可通過海綿效應(yīng)吸附miR-143，使結(jié)直腸癌細胞的放射抗性得到增強。miR-143-3p 可與結(jié)直腸癌細胞中FZD4的3'UTR相互作用，而FZD4過表達可部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞中miR-143-3p介導的抑癌作用［26］。本研究結(jié)果顯示，實驗組增殖能力、S期細胞比例均高于對照組，凋亡水平、Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對表達量及G1期細胞比例均低于對照組。這表明circLMNB1表達下調(diào)可抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、促進其凋亡、阻滯細胞周期。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，實驗組miR-143表達高于對照組，雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，circLMNB1 可直接與miR-143 相互作用，提示circLMNB1 可通過miR-143介導結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，circLMNB1 表達下調(diào)可抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、促進其凋亡、阻滯細胞周期，可能是通過與miR-143 相互作用來實現(xiàn)的。上述結(jié)果進一步豐富了circRNA 調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，也為circLMNB1 作為結(jié)直腸癌的治療靶點提供了新的證據(jù)。