過量維生素D3灌胃的Wistar大鼠毒性反應(yīng)及組織器官鈣化觀察

游贛花 ，龍向淑 ，周瑜 ，黃晶 ，何尤夫 ，宋方 ，田茂波 ，肖燕 ，鄧世燕 ，吳強

1 貴州省食品藥品檢驗所，貴陽550004；2 貴州大學醫(yī)學院；3 貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科

維生素D（VitD）是一種脂溶性的維生素，主要包括VitD3和VitD2。VitD3的經(jīng)典生物學作用是調(diào)節(jié)機體鈣磷平衡，維持骨骼健康［1］。目前，VitD3臨床應(yīng)用廣泛，然而隨著VitD3補充劑的使用增加，不良反應(yīng)時有發(fā)生。據(jù)報道，VitD3毒性多因使用不當，或在治療佝僂病的過程中反復大劑量使用所致［2］。研究表明，外源性VitD 補充劑引起的鈣磷調(diào)節(jié)異常可能導致組織器官損傷［3］，如軟組織中礦物質(zhì)沉積引起骨外器官鈣化和器官功能障礙［4］。值得注意的是，VitD 的毒性是由補充物引起的，而不是由飲食或日曬引起。為探討VitD3的毒性反應(yīng)及主要組織器官的病理改變，2020 年6~12 月，本研究以Wistar雄性大鼠為研究對象，觀察短期內(nèi)大劑量給予VitD3出現(xiàn)的毒性反應(yīng)，以及心臟、肝臟、腎臟、肺、血管的鈣化情況。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 清潔型Wistar 雄性大鼠購自湖南天勤生物有限公司，共40 只，體質(zhì)量（170±10）g，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，自由進食飲水，12 h 明/暗環(huán)境，溫度20~26 ℃，相對濕度40%~70%，所有動物實驗操作均符合貴州醫(yī)科大學的動物福利倫理委員會的要求。VitD3注射液購自哈爾濱市華晟科技動物藥品廠。二甲苯、無水乙醇購自天津富宇化工有限公司。山羊血清、二抗、DAB顯色液、檸檬酸鹽購自北京中杉金橋生物有限公司。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）羊抗兔單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)公司。4%多聚甲醛、蘇木素、茜素紅染液購自北京索萊寶科技有限公司。GZX-9246MBE 電熱鼓風干燥箱購自上海博迅實業(yè)公司。DK-98-IIA 電熱恒溫水浴鍋購自天津泰斯特儀器有限公司。倒置光學顯微鏡購自日本Olympus 公司。Nanodrop 分光光度儀購自美國Thermo-fisher 公司。PCR檢測儀購自美國Illumina公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司。引物合成由上海生物工程技術(shù)公司完成。

1.2 動物分組及給藥方法 40 只Wistar 大鼠隨機分為對照組和給藥組，每組20 只。給藥組給予VitD370 萬U/kg 灌胃，對照組同法給予等體積蒸餾水，隔天1 次，共灌胃2 次。于灌胃結(jié)束1 周后處死大鼠，取心臟、肝臟、腎臟、肺、血管組織備檢。

1.3 一般情況觀察 灌胃后每天記錄大鼠精神狀態(tài)、進食情況、毛發(fā)、尿便性狀及大鼠死亡情況。

1.4 組織器官病理變化及鈣化情況觀察 取大鼠心臟、肝臟、腎臟、肺、血管組織。①HE 染色觀察組織器官病理變化：取適量組織經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h 后，常規(guī)石蠟包埋，5 μm 切片；依次放入二甲苯Ⅰ 10 min，二甲苯Ⅱ 10 min，100%乙醇5 min，95%乙醇5 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，75%乙醇5 min，蒸餾水洗10 min 脫蠟至水，蘇木素染細胞核，伊紅液染細胞質(zhì)；再將切片依次放入95%乙醇5 min，95%乙醇5 min，100%乙醇5 min，100%乙醇2 min，二甲苯Ⅰ3 min，二甲苯Ⅱ5 min，脫水、透明，稍干后中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并進行圖像采集。②茜素紅染色檢測各組織器官鈣化情況：取適量組織經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，常規(guī)石蠟包埋，5 μm 切片，用0.1%茜素紅溶液（pH 8.3）37 ℃染色30 min，以磷酸鹽緩沖液洗2~3次，置于顯微鏡下觀察鈣化灶。

1.5 組織器官中BMP2 mRNA及蛋白檢測

1.5.1 qRT-PCR 法檢測BMP2 mRNA 取心臟、肝臟、腎臟、肺、血管組織。使用TRIzol 提取組織總RNA，用NanoDrop2000 分光光度計檢測RNA 濃度，計算A260/A280。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA 產(chǎn)物。根據(jù)SYBR PrimeScript 兩步法進行擴增：95 ℃ 1 min 進行酶的活化，95 ℃ 15 s，60 ℃1 min 擴增 40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃15 s擴增熔解曲線，獲得每個樣品的Ct值。以GAP?DH 為 內(nèi)參 ，以 2?ΔΔCt表 示目 的 基因 相對 表 達量 。BMP2 mRNA 上游引物序列為5'-TTCCATCAC?GAAGAAGCCGT-3'，下游引物序列為5'-GAAACTC?GTCACTGGGGACA-3’。GAPDH 上游引物序列為5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'，下游引物序列為5'-CCACTTTGTCACAAGAGAAGGC-3'。

1.5.2 免疫組化法檢測BMP2 蛋白 取心臟、肝臟、腎臟、肺、血管組織。組織切片烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸鹽抗原修復，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉。切片稍甩干，滴加一抗（BMP2 一抗稀釋比為1∶100），4 ℃冰箱過夜?；厥找豢?，PBS 洗 3 次×10 min。滴加 HRP 標記的二抗，室溫孵育1 h。DAB 顯色，蘇木素復染細胞核，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照保存。胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染判定為BMP2 陽性細胞。每張切片選5 個視野觀察，陽性細胞百分比<5% 計 0 分，5%~25% 計 1 分，26%~50% 計 2 分，51%~75%計3 分，>75%計4 分；按染色強度計分，無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，黃褐色計3分；陽性細胞百分比計分與染色強度計分相乘，作為蛋白相對表達量［5］。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用Graph Pad Prism7.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況變化 對照組大鼠一般情況良好；VitD3給藥組大鼠死亡9只，其余大鼠存活至實驗結(jié)束。給藥組大鼠在給予VitD3的第2 天出現(xiàn)明顯的精神萎靡、嗜睡、進食量減少、毛發(fā)無光澤、口角有血跡，出現(xiàn)咖啡色尿，解剖后發(fā)現(xiàn)彌漫性肺出血及腸梗阻現(xiàn)象。

2.2 兩組大鼠組織器官病理變化 與對照組相比，給藥組大鼠心肌肌纖維排列紊亂，部分心肌變性壞死、灶性鈣鹽沉積；部分腎小管內(nèi)可見管型及鈣鹽沉積；肺組織內(nèi)見肺泡擴張、部分肺泡融合，肺泡間隔纖維組織增生、玻璃樣變性及炎細胞浸潤；血管內(nèi)膜欠光滑，中膜平滑肌細胞排列紊亂，并可見灶性鈣鹽沉積。給藥組肝臟未見明顯病理改變。見圖1。

圖1 給藥組與對照組大鼠組織器官病理改變（HE染色）

2.3 兩組大鼠組織器官鈣化情況 對照組未見紅色結(jié)節(jié)，給藥組大鼠心臟、腎臟、肺、血管均可見較多紅色結(jié)節(jié)，而肝臟中未見紅色結(jié)節(jié)。見圖2。

圖2 給藥組與對照組大鼠組織器官鈣化情況（茜素紅染色）

2.4 兩組大鼠組織器官中BMP2 mRNA 表達比較 見表1。

表1 兩組大鼠組織器官中BMP2 mRNA表達比較（）

表1 兩組大鼠組織器官中BMP2 mRNA表達比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

BMP2 mRNA組別 n血管1.00±0.10 1.58±0.15*肺對照組 20給藥組 20心臟1.00±0.14 2.23±0.51**肝臟1.00±0.11 1.16±0.21腎臟1.00±0.11 1.77±0.44**1.00±0.06 2.06±0.51**

2.5 兩組大鼠組織器官中BMP2 蛋白表達比較 見圖3、表2。

圖3 兩組大鼠組織器官中BMP2蛋白表達情況（免疫組化法）

表2 兩組大鼠組織器官中BMP2蛋白表達比較（）

表2 兩組大鼠組織器官中BMP2蛋白表達比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

BMP2蛋白組別 n肺心臟2.20±1.10 5.60±1.67**血管1.40±0.55 4.40±1.67*肝臟0.60±0.55 0.40±0.55對照組 20給藥組 20腎臟1.80±0.45 8.20±2.49**0.20±0.45 6.60±1.95**

3 討論

VitD 是體內(nèi)骨骼和礦物質(zhì)平衡所必需的營養(yǎng)元素，其生物學效應(yīng)通過腎臟將VitD 的活性形式1α，25（OH）2D3轉(zhuǎn)移到存在VitD 受體（VDR）的靶器官中來實現(xiàn)。1α，25（OH）2D3-VDR 信號不僅存在于調(diào)節(jié)鈣和磷酸鹽穩(wěn)態(tài)的VitD 經(jīng)典靶器官如腸道、骨骼、腎臟和甲狀旁腺中，還存在于非VitD 的經(jīng)典靶細胞中，包括皮膚角質(zhì)形成細胞、胰腺β 細胞、心肌細胞等［6］。

目前，有關(guān)VitD 多系統(tǒng)作用的科學證據(jù)不斷增加，VitD 影響著包括腎臟、心臟在內(nèi)的多種器官，并且在器官的發(fā)育和功能維持中發(fā)揮重要作用［7-8］。研究表明，VitD 與急性腎損傷之間存在復雜的關(guān)系。VitD 缺乏或過量可引起急性腎損傷，而且急性腎損傷還可導致VitD 的穩(wěn)態(tài)和功能失調(diào)，且VitD 可以作為急性腎損傷治療中潛在的新型預后生物標志物和治療藥物。此外，即使在無毒劑量下，VitD 在心血管病理生理學中也會呈現(xiàn)兩相劑量反應(yīng)曲線，并可能造成有害影響［9］。

軟組織中發(fā)生的病理性鈣化沉積稱為異位鈣化。當鈣磷乘積大于40時，磷酸鈣結(jié)晶開始在身體靶組織器官累積，造成器官功能障礙甚至衰竭［10］。本研究中，當大鼠給予70 萬U/kg 的VitD3灌胃兩次后，給藥組20只大鼠死亡9只，并出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、進食量減少、毛發(fā)無光澤、口角有血跡、咖啡色尿、彌漫性肺出血及腸梗阻等急性中毒癥狀。由HE 染色結(jié)果可知，短期內(nèi)給予過量VitD3后，大鼠心臟、腎臟、肺、血管中均出現(xiàn)不同程度的鈣化灶，并出現(xiàn)肌纖維排列紊亂、變性、壞死及炎細胞浸潤等病理改變。茜素紅染色顯示，對照組未見紅色結(jié)節(jié)，給藥組大鼠心臟、腎臟、肺、血管均可見較多紅色結(jié)節(jié)，而肝臟中未見紅色結(jié)節(jié)。因此，我們推測，軟組織器官鈣化的累積生理效應(yīng)造成器官功能障礙引起了大鼠死亡。肝臟是VitD3的代謝器官，VitD3在肝臟中被25-羥化酶代謝，再由腎臟1α-羥化酶轉(zhuǎn)化為其活性形式，與 VDR 在不同組織中發(fā)揮作用［15］。然而，本研究中HE 染色及茜素紅染色均未觀察到肝臟發(fā)生鈣化，我們推測原因可能為肝臟對VitD3的代謝速率較快，具體原因有待進一步探索。

BMPs是TGF-β家族成員，與成骨分化和異位鈣化密切相關(guān)［12］。BMPs與特異性受體結(jié)合后，通過調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄，誘導機體發(fā)生異位鈣化。BMP2作為BMPs 家族一員，與異位鈣化關(guān)系最為密切。機體在一系列外界刺激下，誘導間充質(zhì)前體細胞分泌BMP2，并激活BMP2 介導的信號通路調(diào)控前體細胞分化為成骨樣細胞，并促進基質(zhì)鈣化［13］。研究表明，與正常動脈組織相比，BMP2 在動脈粥樣硬化鈣化斑塊及纖維帽中表達增高［14］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，給藥組大鼠心臟、腎臟、肺、血管中BMP2 mRNA 及蛋白表達水平均顯著升高，表明過量VitD3給藥可促進上述大鼠臟器鈣化，與HE 染色及茜素紅染色結(jié)果一致。

總之，本研究從VitD3急性中毒癥狀及器官鈣化的角度闡述了VitD3的毒性作用。隨著VitD3補充劑的使用增加，有必要注意VitD3的過量與中毒反應(yīng)。當過量補充VitD3后出現(xiàn)食欲減退、頭痛、惡心、嘔吐、便秘等癥狀時，應(yīng)立即檢測血鈣含量，預防毒性反應(yīng)發(fā)生。