基于計算機分子模擬技術的PD-1單克隆抗體的抗原表位預測及初步驗證

郝偉，范冬梅 ，袁向飛，盧楊

1 中國醫學科學院血液病醫院（中國醫學科學院血液學研究所）實驗血液學國家重點實驗室國家血液系統疾病臨床醫學研究中心 天津市血液病細胞免疫治療重點實驗室，天津300020；2 天津大學中西醫結合醫院，天津大學

抗原與抗體的相互作用是機體產生免疫防御的核心［1］?？贵w是B 細胞接受抗原刺激后增殖分化為漿細胞所產生的糖蛋白，主要存在于血清中，可與相應抗原特異性結合介導體液免疫，發揮免疫功能［2］。抗體與抗原互相識別的區域稱為互補決定區（CDR），或稱表位［3-4］。線性表位由相鄰順序排列的氨基酸構成，構象表位由空間相互靠近的若干氨基酸殘基構成［5］。隨著現代技術的不斷發展，抗原－抗體復合物的解析技術不斷完善，蛋白質結構數據庫中包含的抗原—抗體復合物結構數據不斷增加，可以運用計算機軟件輔助模擬抗原抗體互相識別位點及作用方式［6-7］?？乖砦坏淖兓娠@著影響抗體與其結合能力，因此抗原表位的預測是研究者關注的焦點。本研究通過計算機構建前期篩選得到的鼠源程序性細胞死亡受體1（PD-1）單克隆抗體三維空間結構，利用不同模式優化模擬抗體結構，用重疊肽段覆蓋整個抗原序列來判定抗原表位，使用分子對接程序初步揭示抗原抗體識別特征。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 小鼠成纖維細胞3T3、人急性T 淋巴細胞白血病細胞系Jurkat、人B 細胞淋巴瘤細胞系Raji、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0 均由本實驗保存。Jurkat細胞、Raji細胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基，3T3細胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培養基，于37 ℃、5%CO2培養箱中常規培養。DMEM 培養基、RPMI-1640 培養基、胎牛血清購自美國GIBCO 公司。酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂糖購自英國OXOID 公司。甘氨酸、Tris 堿購自美國Amresco 公司。RIPA 裂解液（中效）、PMSF 購自碧云天生物有限公司。BCA 蛋白定量試劑盒、Western lighting pius ECL 底物 購自 Pierce 公司 。APC 標記大鼠抗小鼠IgG 抗體、PE 標記大鼠抗小鼠IgG1 抗體（二抗）、FITC 直標抗PD-1 單克隆抗體購自BD 公司。

1.2 抗體體外親和力測定 首先將抗體與不表達PD-1的Raji細胞共孵育鑒定抗體特異性。收集Raji細胞，PBS 洗兩次，抗體以終濃度100 nmol/L 與2×105個 Raji 細胞室溫孵育 40 min，PBS 洗兩次，用100 μL 的 PBS 重懸細胞，加入 PE 標記大鼠抗小鼠IgG1 抗體 2 μL，室溫避光孵育 40 min，PBS 洗兩次，細胞重懸于400 μL 的PBS 緩沖液中，流式細胞儀上機檢測。將抗體與表達PD-1 的SP2/0 細胞共孵育鑒定其結合能力。收集對數生長期的SP2/0 細胞（轉染PD-1），PBS洗兩次，將純化好的四株抗體分別進行熒光標記，其中 3D1、2E7、2F6 用 PE 標記，1C7用FITC 標記。將直標抗體以終濃度400 nmol/L 開始進行倍比稀釋，至終濃度0.003 nmol/L，分別與2.5×105個 SP2/0 細胞（轉染 PD-1）室溫避光孵育30 min；1 800 r/min 離心 10 min，棄上清，PBS 洗兩次，將細胞重懸于400 μL 的PBS 緩沖液中，流式細胞儀上機檢測。

1.3 抗體Fab 區模型構建及構象評價 用Discov?ery Studio（DS）軟件中 Macromolecules 模塊的 Inden?tify Framework Templates 程序，將相應抗體的輕、重鏈序列文件導入相應位置，運行程序。運行結束后所有模板按照Identity（%）排序，選擇與待建?？贵w一致性最高的同種屬抗體構象為模板。接下來使用Macromolecules 模塊中 Model Antibody Framework 程序，選擇對應序列文件，在Interface Template 選項中，導入上一步程序得到的模板，運行程序。程序運行結束后選擇PDF Total Energy 值最低的模型進行后續優化。PDF Total Energy 越低，表明該模型在同源約束條件下優化的越好，偏差越小，該模型的可信度越大。最后在Macromolecules 模塊中找到Model Antibody Loops 程序，Input Protein Molecules 選中上一步程序得到的模板，CDR Loop Definition 選擇user自定義CDR，運行程序。程序運行結束后就可得到相應四種 PD-1 抗體 3D1、1C7、2F6、2E7 的 Fab 區三維立體模型結果。

1.4 抗原表位獲取及抗原—抗體表位結合預測 從PDB 數據庫中下載hPD-1 的X 衍射晶體結構（PDB號為3RRQ，圖1）進行去水加氫預處理，將在DS 軟件中構建的四種抗體模型和經過處理的PD-1 抗原使用Dock Proteins（ZDOCK）進行剛性對接，將較大的蛋白設為Recepter，較小的蛋白設為Ligand，Angu?lar Step Size 選擇 6，設置 ZRANK 為False，運行程序。在 Dock and analyze protein complexes 中 ，設 置Browse 為 Top Poses in Largest Clusters，在 Data table中 ，選 擇 ZDOCK 打 分 高 于 12.0 的 Poses，建 立Group，進行后續優化。Macromolecules 中找到Refine Docked Proteins（RDOCK），打開對話框，導入相應的受體配體文件，在Input poses 中，選擇ZDOCK 中建立的Group，運行程序，查看優化后各個Pose 的 E_RDOCK 打分。在 Macromolecules 程序中找到 Analyze Protein Interface 選項，導入 RDOCK 對接結果，Ligand 選擇抗原序列，運行程序，選擇show sequence，查看參與抗體－抗原相互作用的氨基酸。

圖1 PD-1的X衍射晶體結構

1.5 四種抗體與PD-1 蛋白結合能力測定 采用Western blotting 法。收集 Jurkat、3T3/hPD-1+細胞，PBS 洗兩遍，用RIPA 裂解液裂解細胞，12 000 r/min離心15 min 取上清。用BCA 法定量后，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白上樣量均為80 μg/孔。濕轉法將蛋白轉移到硝酸纖維素濾膜（NC 膜）上，將NC 膜加入含5%脫脂牛奶的封閉液中，室溫封閉2 h。封閉結束后，將NC 膜按樣品孔剪開，置于抗體孵育槽內，與用封閉液稀釋至4 μg/mL 的抗體3D1、1C7、2F6、2E7 在4 ℃下輕搖過夜孵育。取出NC 膜，PBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min。用封閉液按1∶3 000 稀釋HRP 偶聯二抗（山羊抗鼠），將NC 膜與二抗工作液室溫孵育2 h；取出NC 膜，PBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min。室溫避光將ECL 底物顯色A、B 液以 1∶1 混合，將混合液滴加到膜上，孵育1 min后將NC膜移至熒光化學發光成像分析儀內進行曝光，觀察所得條帶位置和清晰度，對DS軟件模擬抗原抗體結合表位信息進行驗證。PD-1 是50~55 kDa 的Ⅰ型跨膜受體，Western blotting 過程中，如果抗體結合PD-1時以線性表位為主，則可看到清晰的條帶，若抗體結合時以立體表位為主，則條帶較弱。

2 結果

2.1 抗體體外親和力測定結果 3D1、1C7、2F6、2E7四株抗體與Raji細胞（不表達PD-1）均無交叉反應。進行倍比稀釋的四株抗體均與SP-20 細胞（表達PD-1）有較好的親和力，3D1、1C7、2E7、2F6 的Kd值分別為2.46×10-9、3.1×10-9、3.58×10-9、1.9×10-8M。因此所篩選的四株抗體均與PD-1 陽性細胞具有較好的親和力，而與PD-1 陰性細胞無交叉反應，表明這四株抗體具有較高的特異性。

2.2 抗體Fab區模型構建結果 四種抗體的Fab區模型見圖2。每個抗體的CDR 用黃色標注，可見通過抗體 8 個 FR 骨架區的折疊，6 個 CDR 聚集在一起，形成與抗原結合的特殊口袋。模擬所得拉式圖結果表明，大多數氨基酸均在代表最適區的藍線內，而代表構象不合理氨基酸紅點數量均小于5%，因此構建的四個抗體模型均具有較高的可信度。

圖2 3D1、1C7、2E7、2F6四株抗體的Fab區模型

2.3 抗原－抗體表位結合預測結果 從預測模型（圖3）中可以看出3D1與PD-1結合過程中有一個長達17個氨基酸的線性表位。2F6的結合表位分為三個部分，相對比較集中，且立體表位較少。2E7 以識別PD-1 表面的立體表位為主。1C7 也可識別部分立體表位。

圖3 3D1、1C7、2F6、2E7與PD-1表位結合預測結果

2.4 四種抗體與線性化PD-1蛋白的結合能力 如圖 4 所示，在 Jurkat 細胞中，3D1、2F6 顯示出清晰條帶，位置與 PD-1 蛋白相符，IC7 條帶較弱，2E7 條帶幾乎不可見。 在高表達 hPD-1 的 3T3 細胞（3T3/hPD-1+細胞）中，2E7 條帶微弱可見。因此，在將PD-1 線性化的情況下，3D1 與其結合能力最強，2F6 次之，1C7 較差，2E7 最弱。Western blotting 實驗結果與計算機模擬結果一致。

圖4 四種抗體與線性化PD-1蛋白的結合情況

3 討論

據首次報道使用雜交瘤細胞系開發單克隆抗體以來，治療性抗體相繼問世，其應用領域包括惡性腫瘤、自身免疫性疾病和炎癥等［8］。近年來，單克隆抗體藥物在腫瘤領域的應用越來越廣泛，并且產生了較好療效。研究發現，腫瘤細胞的生長和腫瘤進展均與免疫抑制有關，腫瘤細胞可激活具有不同免疫抑制功能的免疫檢查點途徑的能力。腫瘤細胞高表達程序性細胞死亡配體1 和2（PDL-1/PD-L2），它們可以與T 細胞表面的免疫檢查點蛋白PD-1 相互作用，從而逃避T 細胞介導的免疫殺傷作用［9-10］。靶向免疫檢查點的單克隆抗體為惡性腫瘤治療提供了新的方案［11］。免疫療法被公認為是迄今為止最有潛力的全身性惡性腫瘤治療方法，在增強治療效果尤其是在難治性腫瘤治療中起著不可或缺的作用［12］。PD-1 抗體現已成為多種晚期惡性腫瘤的一線治療用藥［13-14］。

抗原表位在抗體與抗原結合觸發機體免疫反應中起到關鍵性作用，傳統預測抗原表位的方法包括化學裂解法、雜交肽裂解法等手段，通過將抗原分子裂解成不同大小的肽段，將其與特定的抗體進行反應以確定抗原表位［15-16］。這些方法會破壞抗原表位的立體構象，只能預測蛋白的線性表位，忽略抗原的空間構象，工作量大，所得肽段不能擴增且不可重復利用，因此成本過高。隨著生物信息學和分子生物學技術的迅猛發展，計算機對抗原表位進行模擬構建技術越來越成熟。計算機分子模擬技術能準確構建蛋白質三維空間結構，整合結合位點相互作用信息，靈敏度高，大大縮短了研發時間，提高抗體篩選成功率［17-19］。DS 軟件是以生物大分子（蛋白、核酸、多糖）和有機小分子為研究對象的專業分子模擬與設計軟件，應用學科涵蓋生命科學、藥物化學等領域。DS在抗體研發領域的應用日益廣泛，包括抗體序列的識別與分析、抗體結構預測、抗體－抗原相互作用識別、抗體設計等［20-21］。

本研究基于前期篩選得到的四株鼠源PD-1 單克隆抗體 3D1、1C7、2F6、2E7 通過計算機分子模擬技術對其抗原表位進行研究得到初步預測結果。首先通過體外實驗證明四株抗體與PD-1 蛋白具有良好的親和力，接著通過DS軟件成功構建了四種抗體的Fab 區模型，通過對loop 區的優化，提高蛋白質模型的準確性。通過將抗體與PD-1 蛋白三維立體構象相比較，應用ZDOCK 和RDOCK 模塊對四株抗體與PD-1 蛋白的結合構型及分別的抗原表位進行了模擬預測，獲得了抗原抗體相關結構性質與氨基酸序列信息之間的關系。預測結果表明，抗體3D1 結合PD-1 線性表位最多，并且Western blotting 實驗結果顯示抗體3D1與線性化PD-1蛋白結合能力強。

綜上所述，本課題通過計算機分子模擬技術，基于抗原立體空間構象的基礎上，快速、合理的對抗原抗體結合表位進行了預測，根據預測結果縮小目標抗體范圍，降低了抗原表位鑒定的難度。該技術為抗體研究者提供了易于操作使用的建模環境，有助于抗體新藥研發，提高抗體成藥性，加快抗體研發周期，降低研發成本。