中醫藥治療布魯氏菌病的用藥規律及藥物作用機制分析

張鵬葛，王一瑞，劉紀杉，高輝，周衛剛

新疆醫科大學第八附屬醫院藥學部，烏魯木齊830013

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人獸共患的傳染－變態反應性疾病［1］。本病主要通過皮膚黏膜接觸、呼吸道、消化道傳播途徑感染［2-3］，發病后癥狀表現復雜，其臨床表現不一，特異性的病癥少［4-5］，極易出現誤診誤治，延誤病情［6］，容易導致疾病急性期轉至慢性期，增加治愈難度［7］。相關文獻表明，感染的布魯氏菌主要在細胞內寄生，抗菌藥物很難進入機體而發揮作用，所以治療后容易復發［8-9］。中醫認為，本病屬感受濕熱病邪所致到初起濕遏衛氣，故見發熱，脾胃受累，更見中焦運化失司，氣機受阻，清陽不升，肌腠開泄，故見汗出，濕性重濁黏滯，久之可乘虛入絡，循經傷及諸臟及關節［10］。中藥不良反應小，不易產生耐藥，用于布魯氏菌病的治療效果顯著。因此，本研究基于數據挖掘技術和網絡藥理學分析中醫藥治療布魯氏菌病的用藥規律及藥物作用機制，為臨床中醫藥治療布魯氏菌病提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 治療布魯氏菌病主要中藥處方出處及中藥性味歸經處理 調取新疆醫科大學第八附屬醫院2018 年1 月—2019 年12 月治療布魯氏菌病的中藥處方。參考《中華人民共和國藥典》對中藥名稱進行規范化處理，如元胡、玄胡統稱為延胡索，中藥炮制未注明者按照生者錄入，中藥合寫者將其分開如乳沒分為乳香、沒藥等。為確保結論準確性，處方重復者，只取其一。通過Microsoft Excel 軟件對處方中的中藥進行藥類、四氣五味、歸經的頻次及頻率的統計分析。出現頻率=每類藥物出現的數量/出現的所有中藥數量。使用頻率=出現某類藥物的使用數量/藥物的總的使用數量。

1.2 治療布魯氏菌病主要中藥處方中藥物的關聯規則分析 采用SPSS Modeler18.0 軟件對藥物進行關聯規則和可視化網絡圖分析，以全面展示藥材之間的聯系。在關聯規則分析中，支持度表示藥材組合出現的頻次占處方總數的百分比，置信度表示當A 藥材出現時，B 藥材也出現的概率。選取合適的支持度、置信度以提取核心藥材組合［11-13］。

1.3 治療布魯氏菌病主要中藥處方中藥物的聚類分析 采用SPSS20.0軟件對藥物進行聚類分析，研究中藥臨床使用的分類情況［14-15］。

1.4 網絡藥理學分析

1.4.1 核心中藥活性化合物的篩選 依托中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）檢索核心中藥的所有化合物。將參數設置為口服吸收利用度（OB）≥30%、藥物相似性（DL）≥0.18 作為篩選條件進行篩選，獲取核心中藥的主要活性化合物。

1.4.2 藥物－化合物－靶點網絡的構建 利用TCMSP 數據庫查詢核心中藥活性化合物的作用靶點信息。將得到的靶點蛋白和基因信息通過Uni?port、GeneCards 數據庫標準化，得到核心中藥活性化合物對應的關鍵靶點的基因名。再將藥物、化合物、靶點基因導入Cytoscape 軟件，構建藥物－化合物－靶點網絡。

1.4.3 核心靶點蛋白質－蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建 利用GeneCards 數據庫篩選布魯氏菌病的相關靶點。將藥物活性成分相關靶點與疾病相關靶點取交集，取重合靶點與“1.4.2”中的顯著靶點為核心靶點，再將核心靶點蛋白通過STRING 數據庫構建靶點蛋白的PPI網絡，最后將得到的PPI信息導入Cytoscape軟件，得到PPI網絡圖。

1.4.4 核心中藥活性化合物作用靶點功能通路分析 將篩選得到的核心中藥活性化合物作用靶點導入Metascape數據庫，通過輸入靶基因名稱列表并選定物種為“homo sapiens”，將所有靶基因名稱校正為標準化名稱，經上述數據庫檢索和轉化操作，進行GO 分析和 KEGG 分析，設定P<0.05 為有顯著性富集。最后用Cytoscape 軟件構建靶點－信號通路網絡圖，進一步說明靶點和信號通路在布魯氏菌病治療中的作用。

2 結果

2.1 中藥使用頻數、藥性、歸經分析結果

2.1.1 中藥使用頻數 共收集到治療布魯氏菌病的有效中藥處方1 095 張，共使用275 味中藥。以累積使用頻率80%以上的中藥反映處方中主要用藥規律，共統計出81味中藥。排名前10位的依次為蜜炙甘草（729 次）、當歸（603 次）、茯苓（470 次）、陳皮（400 次）、白芍（385 次）、川芎（372 次）、炒白術（337次）、黃芪（330次）、黨參（291次）、生地黃（288次）。

2.1.2 中藥四氣分布 對81 味中藥四氣分布進行統計，四氣出現頻率和使用頻率最高者為溫。具體見表1。

表1 治療布魯氏菌病主要中藥處方中藥物的四氣分布

2.1.3 中藥五味分布 對81 味中藥的五味分布進行統計，五味出現頻率和使用頻率最高者為甘。具體見表2。

表2 治療布魯氏菌病主要中藥處方中藥物的五味分布

2.1.4 中藥歸經分布 對81 味中藥歸經分布進行統計，歸經出現頻率和使用頻率最高者為脾（胃）。具體見表3。

表3 治療布魯氏菌病主要中藥處方中藥物的歸經分布

2.1.5 中藥藥類分布 對81 味中藥的藥類分布進行統計，藥類出現頻率和使用頻率最高者為補虛藥。排名前5的藥類信息具體見表4。

表4 治療布魯氏菌病主要中藥處方的藥類分布

2.2 中藥藥物之間的關聯分析結果 根據同現關系，將使用累積頻率在80%以上的81味中藥之間的關聯規則用網絡視圖方式展示，發現分成四組，第一組包括牡丹皮、乳香、沒藥、獨活、防己等；第二組包括生地黃、北沙參、知母、淡竹葉、梔子、丹參等；第三組包括黨參、麥冬、炒麥芽、蜜炙甘草、續斷、鹽杜仲等；第四組包括黃芪、牡丹皮、五味子、當歸、陳皮、茯苓、白芍、川芎、炒白術等。將常用中藥進行關聯規則挖掘，將支持度設為15%、置信度設為85%，得到關聯規則共4個。具體見表5。

表5 治療布魯氏菌病常用中藥關聯規則分析結果

2.3 中藥之間的聚類分析結果 將使用累積頻率在80%以上的81味中藥進行聚類分析，當閾值為25時，81 味中藥被聚類為四大類，與關聯分析結果相印證。具體見表6。

表6 治療布魯氏菌病常用中藥聚類分析結果

2.4 網絡藥理學分析結果 根據中藥的頻數分析、關聯規則分析、聚類分析結果，結合布魯氏菌病的病機，總結中藥治療布魯氏菌病的用藥規律為：急性期主要以清熱化濕、活血通絡為主，核心用藥為生地黃、北沙參、知母、淡竹葉、梔子、牡丹皮、乳香、沒藥、獨活、防己等；慢性期主要以補氣生血、活血止痛、補肝腎強筋骨為主，核心用藥為黃芪、當歸、黨參、蜜炙甘草、茯苓、續斷、鹽杜仲、牡丹皮、川芎。

2.4.1 核心中藥化合物 通過TCMSP 數據庫檢索后，篩選較高活性的化合物。其中治療急性期化合物：生地黃2個、北沙參8個、知母15個、淡竹葉3個、梔子 15 個、牡丹皮 11 個、乳香 8 個、沒藥 46 個、獨活9個、防己3個，合計120個，在刪除54個重復化合物后共有66 個成分納入候選化合物。治療慢性期化合物：黃芪 20 個、當歸 2 個、黨參 21 個、蜜炙甘草 92個、茯苓15個、續斷8個、鹽杜仲28個、牡丹皮11個、川芎7 個，合計204個，在刪除61個重復化合物后共有143個成分納入候選化合物。

2.4.2 藥物－化合物－靶點網絡圖 建立急性期核心中藥－有效成分－靶點的藥理網絡。其中等級值較大的成分有北沙參、梔子、牡丹皮、沒藥的共有成分quercetin；北沙參、梔子、獨活、沒藥、防己的共有成分beta-sitosterol；知母、梔子、牡丹皮的共有成分kaempferol；地黃、北沙參、知母、梔子、沒藥的共有成分Stigmasterol；淡竹葉成分luteolin；知母成分Anhydroicaritin。急性期治療相關顯著基因包括PTGS2、NCOA2、PGR、GABRA1、PTGS1、CHRM1、SCN5A、ADRB2、NR3C2、RXRA、ADRA1B、CHRM2。建立慢性期核心中藥－有效成分－靶點的藥理網絡。其中等級值較大的成分有黃芪、甘草、杜仲、牡丹皮的共有成分quercetin、kaempferol；當歸、續斷、杜仲的共有成分beta-sitosterol；黨參成分luteolin；黃芪成分7-O-methylisomucronulatol；杜仲成分Cin?chonan-9-al、6'-methoxy-、（9R）-；川芎成分 Myrican?one。慢性期治療相關顯著基因包括PTGS2、NCOA2、ESR1、NOS2、AR、PRSS1、PTGS1、SCN5A、CDK2、GSK3B、ESR2、CCNA2、DPP4、MAPK14、CHEK1、RXRA、ADRB2、ACHE、ADRA1B、F7、CHRM1、PDE3A。

2.4.3 靶點PPI 網絡分析結果 從Genecards 數據庫中篩選得到80 個布魯氏菌病相關靶點。然后將232個中藥成分靶點與80個疾病相關靶點繪制韋恩圖，得到17 個重合靶點。結合“2.4.2”結果所得26個顯著基因靶點，去除重復靶點，一共獲得42 個核心靶點。在STRING 數據平臺上輸入42 個核心靶點，分析后得到PPI 網絡圖，蛋白質相互作用等級值排名靠前的分別為 IL6、TNF、PTGS2、MMP9、CX?CL8、CAT、IL10、IL2、CRP、ESR1、IL4、MAPK14。

2.4.4 GO 富集分析和KEGG 通路分析結果 使用Metascape 網站對潛在靶點進行GO 富集和KEGG 通路注釋分析，得到了P<0.05 的GO 條目共計820 個，其中包含生物過程（BP）條目754 個、分子功能（MF）條目47 個、細胞組成（CC）條目19 個；KEGG 通路條目73個，具體見表7、8。將得到的通路條目、靶點信息導入Cytoscape 軟件，繪制得到靶點－通路圖，其中核心靶點蛋白主要有MAPK14、IL6、TNF、IFNG、TGFB1、CXCL8、GSK3B、IL10、IL2、IL4、CDK2。

3 討論

本研究對治療布魯氏菌病所用中藥藥性統計分析表明，溫寒、甘苦性藥物最常用。溫性藥能活血化瘀、溫經通絡；甘味藥能補、能緩、能和，有補虛、和中、緩急之功；寒性藥能清熱瀉火、涼血解毒；苦味藥能泄、能燥、能堅［16］。常用藥物的性味能相對反映出中醫臨床治療布魯氏菌病的用藥思路，即溫經通絡、補虛和中、清熱解毒為基礎的治療原則。對治療布魯氏菌病所用中藥歸經統計分析顯示，歸經為脾（胃）最高、肝（膽）次之。與布魯氏菌病病機即濕熱毒邪經口或皮膚經絡外犯肌表、侵入中焦、傷及肝脾、損及全身相吻合［17］。

統計治療布魯氏菌病所用中藥藥類發現，補虛藥、活血化瘀藥、清熱藥使用頻率較高，與中醫辨證認為急性布魯氏菌病多屬濕溫、濕熱范疇，慢性期則歸痹癥、虛損范疇相符合［18］。清熱祛濕主要針對其實證，補氣血調陰陽主要針對其虛證，從而達到扶正不留邪，祛邪不傷正的多角度中醫藥治療效果。

通過藥味關聯發現，第一組中藥有活血通絡、祛濕止痛的作用，第二組中藥有清熱瀉火、養陰生津作用，第三組中藥有健脾益氣、補肝腎強筋骨的作用，第四組中藥有補氣生血、健脾除濕、活血止痛的作用。結合中醫辨證，第一組和第二組用于治療布魯氏菌病急性期，除濕熱；第三組、第四組用于治療疾病慢性期，補虛損。同時發現，活血通絡貫穿治療該病的全程，可以促進人體血流微循環，減輕肢體疼痛、麻木等癥狀，提高藥物吸收率，提升治療效果。

本文利用網絡藥理學研究中藥的有效成分，構建活性成分－靶點交互網絡圖，發現10個顯著有效化合物。其中，槲皮素通過抑制NF-κB信號通路，減少NF-κB、ICAM-1 的產生，達到抗炎作用［19］；β-谷甾醇其抗炎作機理為抑制PGE2、緩激肽、組胺等炎癥介質的活性，同時抑制游離細胞游走［20］；山奈酚作為常見的黃酮類化合物，通過降低MAKP、NF-κB 等通路的活性來抑制TNF-α、IL6、IL10 等因子水平，發揮抗炎作用［21］；豆甾醇具有較強的生理活性和表面活性，具有抗炎、抗氧化等功效；木犀草素具有消炎、抗菌、抗病毒等作用。

結合PPI 網絡圖結果，本研究發現，自由度較高的靶點有PTGS1 和PTGS2，參與紅素結合和控制雙加氧酶活性，產生炎癥反應，提高促炎介質水平。NOS2充當生物介質參與多種生物過程，包括神經信號傳遞、抗腫瘤活性和抗微生物免疫等［22］。NCOA2表達于多種激素反應組織，主要參與生殖發育、骨形態發生其他病理過程。ESR1、ESR2、AR、PGR 對性發育和生殖功能至關重要，并且在骨組織等其他組織中也起著重要作用。IL6 能增加急性期蛋白合成，催化并放大炎癥反應。TNF 是一種關鍵的細胞

因子，可以參與多種細胞內信號通路，包括細胞的凋亡和存活及炎癥反應和免疫功能的調節。MMP9 可通過釋放VEGF 參與血管生成。CXCL8可趨化中性粒細胞而實現對炎癥反應的調節，還有很強的促血管生成作用。

表8 中藥治療布魯氏菌病的核心靶點KEGG富集分析結果

通過對關鍵靶點的KEGG 富集分析，本研究發現，IL17 通過相應的受體發出信號激活下游途徑（NF-κB、MAPK、C/EBP），誘導抗菌肽、趨化因子和細胞因子表達，在急性和慢性炎癥反應中都起著關鍵作用［23］。Th17 細胞分化通路主要進行細胞外微生物的免疫應答和免疫疾病的有關過程，主要調節IL17 的表達，對于免疫調節和宿主保護十分重要［24］。NF-κB 通路參與細胞對外界刺激的響應，在細胞的炎癥反應、免疫應答等過程中起到關鍵性作用。細胞因子?細胞因子受體相互作用信號通路主要調節細胞的生長和分化，參與免疫、炎癥反應和創傷愈合。破骨細胞分化通路在骨發育、生長、修復、重建中具有重要作用。

靶點－通路圖主要靶點中，MAPK14 是MAP 激酶家族的一員，宿主細胞可通過抑制MAPK14 抑制病毒，并且與多種細胞活動聯系密切，如參與細胞分化、增殖、轉錄調控、免疫調節等，并促進炎癥細胞因子調控激活［25］。TGFB1 在骨重塑中起重要作用，它是成骨細胞介導骨形成的有力刺激劑，可引起致密成骨細胞的趨化、增殖和分化。

綜上所述，本研究從數據挖掘和網絡藥理學角度系統分析了中藥治療布魯氏菌病的作用機制。該病急性期治療以清熱化濕、活血通絡為主，核心用藥為生地黃、北沙參、知母、淡竹葉、梔子、牡丹皮等；慢性期治療以補氣生血、活血止痛、補肝腎強筋骨為主，核心用藥為黃芪、當歸、黨參、蜜炙甘草、茯苓、續斷等。關鍵活性成分包括槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、木犀草素，其主要通過調節PTGS1、PTGS2、IL6、TNF、MAPK14、MMP9、TGFB1、CXCL8等靶點，調控IL17信號通路、Th17細胞分化、破骨細胞分化等信號通路來抑制炎癥、改善骨關節功能、調節免疫、保護神經功能從而達到治療的目的，與中醫辨證治療理念相一致，為布魯氏菌病的臨床治療提供了參考依據。