HBx 轉染的肝癌Huh7 細胞中差異表達mRNA、lncRNA篩選及其功能分析

曹永成，張晶 ，王翠翠，辛萱，曹瑞雪，姜貝貝，劉曉紅

1 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六〇醫院病理科，濟南250031；2 山東省立第三醫院病理科

乙型肝炎病毒（HBV）感染是肝細胞肝癌（HCC）發病的主要危險因素［1］。HBV 基因組含有4 個開放讀碼框，其中最小的X 基因編碼含145~154 個氨基酸的HBV X（HBx）蛋白。現有研究證實，HBx 蛋白通過與各種細胞因子和生長因子相互作用、或通過調節許多細胞信號通路激活，間接觸發病毒和細胞的啟動子或增強子，從而加速肝癌的發展［2-6］，但其具體分子機制尚不明確。長鏈非編碼RNA（ln?cRNA）是長度大于200 nt 且不具有編碼蛋白質功能的 RNA［7］。lncRNA 由于具有較長的核苷酸鏈，其復雜的二級空間結構含有多個蛋白質結合位點，或與DNA、RNA 特異性結合，形成復雜、精確的基因表達調控網絡［8］。越來越多的證據表明，lncRNA 在細胞增殖、侵襲轉移、自噬和凋亡等多種生物過程中發揮重要作用，也參與了包括HCC 在內的多種惡性腫瘤的進展［9-10］，而 lncRNA 在 HBV 相關 HCC 發病中的作用及機制有待深入研究。本研究利用lncRNA 芯片觀察HBx 相關HCC 腫瘤細胞中的mRNA 和lncRNA表達譜，篩選HBx 誘導的HCC 潛在的關鍵調控基因，并進行功能分析，為進一步研究HBx 作用的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 肝癌細胞Huh7購自中國科學院細胞庫。真核表達載體pcDNA3.1和脂質體Lipo?fectamine2000 轉染試劑盒購自美國Invitrogen 公司。鼠抗HBx單克隆抗體（57760）、辣根過氧化酶（HRP）標記的鼠抗兔IgG 二抗、ECL 化學發光檢測試劑盒購自美國Santa Cruz公司。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒購自上海碧云天公司。G418 培養基、胎牛血清、DMEM 培養基購自美國Gibco BRL 公司。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自美國Bio-Rad 公司。lncRNA Array3.0（8×60 K）芯片購自美國Arraystar 公司。TRIzol 試劑、SuperScriptⅢ逆轉錄酶購自美國Invitrogen公司。

1.2 HBx 轉染Huh7 細胞 從NCBI 數據庫下載野生型HBx 基因（HBx-FJ）的CDS 區序列，采用重疊延伸聚合酶鏈反應（OE-PCR）分段擴增，以第一輪PCR產物作為模板，拼接為全長基因，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶預期大小為465 bp。將全長HBx 和pcDNA3.1 擴增產物分別用限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ進行酶切，T4 DNA ligase 連接酶切后的PCR 產物及載體pcDNA3.1，將10 μL連接產物轉化至DH5α 感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素抗性的LB 平皿，37 ℃培養過夜至克隆長出。次日進行菌落PCR，將陽性克隆抽提質粒。Huh7細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM 培養基中，轉染前1 d將細胞以3×105/孔的密度接種于6 孔板，將細胞隨機分為 HBx-FJ 組和 pcDNA3.1 組，分別轉染 4 μg 的pcDNA3.1-HBx-FJ 或 pcDNA3.1。G418 篩選穩定轉染細胞。Western blotting法在HBx-FJ組細胞檢測到陽性條帶，而在pcDNA3.1 組未檢測到陽性條帶。標準變性瓊脂糖凝膠電泳檢測各組穩轉細胞總RNA的完整性符合芯片雜交要求。

1.3 HBx-FJ 組和 pcDNA3.1 組差異表達 mRNA、lncRNA 篩選 lncRNA Array3.0（8×60 K）芯片包括來自Refseq、UCSC knowngenes、Gencode 等權威數據庫和高影響因子論文中的lncRNA，可以檢測人類30 586個lncRNA 和26 109個mRNA 的轉錄本，芯片上也包括陽性探針（管家基因）和陰性探針。根據制造商的標準協議進行樣本制備和芯片雜交。使用Agilent DNA 微陣列掃描儀掃描芯片，Agilent Fea?ture Extraction 軟件提取數據，Agilent Gene Spring GX11.5.1 軟件進行歸一化和數據分析，通過t檢驗篩選差異表達的mRNA 和lncRNA，篩選標準為折疊倍率（FC）≥2.0、兩組差異有統計學意義（P<0.05）、錯誤發現率（FDR）<0.05。

1.4 HBx-FJ 組和 pcDNA3.1 組差異表達 mRNA 功能分析 繪制散點圖對數據進行質量評估，直觀反映差異表達mRNAs 和lncRNAs 的分布情況。對差異表達mRNAs 和lncRNAs 進行分層聚類分析，以使這些差異基因能夠進行適當分類，分在同一簇的基因具有相似的生物學性質。以全部差異表達的mRNA 為目標基因，以KEGG 通路數據庫中全部基因為參照基因，利用可視化整合注釋數據庫將目標基因與KEGG Pathway 數據庫關聯，利用χ2檢驗比較目標基因中與某一條通路相關基因所占比例和參照基因中與該通路相關基因的比例，若P<0.05，該通路即為目標基因中富集的通路。將目標基因放入GO 數據庫進行分析，對其功能進行注釋。以GO 數據庫中全部基因為參照基因，利用χ2檢驗比較目標基因中與某一條GO 術語相關基因所占比例和參照基因中與該術語相關基因的比例，若P<0.05，該術語即為目標基因中富集的GO術語。

1.5 HBx 轉染的Huh7 細胞中差異表達mRNA、lncRNA的RT-qPCR檢測驗證 對lncRNA芯片檢測結果進行交集分析，尋找差異表達的mRNA 及可能參與調控的同時差異表達的lncRNA，變化趨勢符合相互作用的mRNA及lncRNA序列。根據既往文獻，選擇 6 個關鍵 mRNA 在 HBx 轉染的 Huh7 細胞中進行驗證。樣本總RNA 提取、cDNA 合成和PCR 反應根據說明書進行。以2?ΔΔCt表示目的基因相對表達量。實驗重復3次。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件。計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBx-FJ 組和pcDNA3.1 組差異表達mRNA、lncRNA 篩選結果 與 pcDNA3.1 組相比，HBx-FJ 組表達上調mRNA 253 個，表達下調mRNA 321 個；表達上調lncRNA 1 108個，表達下調lncRNA 1 182個。變化倍數最大的前5 個差異表達mRNA 和lncRNA見表1、表2。

表1 HBx-FJ組和pcDNA3.1組差異表達變化倍數最大的前5個mRNA

表2 HBx-FJ組和pcDNA3.1組差異表達變化倍數最大的前5個lncRNA

2.2 HBx-FJ 組和 pcDNA3.1 組差異表達 mRNA 功能分析結果 散點圖及分層聚類分析結果顯示，HBx-FJ 組細胞存在顯著差異表達的mRNA 和lncRNA。差異表達的基因能將pcDNA3.1 組和HBx-FJ 組正確分類。HBx-FJ 組和 pcDNA3.1 組差異表達mRNA的功能主要參與離子通道、跨膜轉運、抗體的處理和呈遞及蛋白加工的調節等方面。見OSID 碼圖 1。HBx-FJ 組表達上調的 mRNA 參與的通路有10 條，表達下調的mRNA 參與的通路有24條。差異表達mRNA主要參與轉錄失調、信號轉導、鈣信號通路等途徑。見OSID碼圖2。

2.3 差異表達mRNA的RT-qPCR檢測結果 HBx轉染的 Huh7 細胞中，6 個差異表達 mRNA（ASAP3、CFTR、POSTN、CAMTA1、ESRRG、ROBO1）的RT-qPCR檢測結果與芯片檢測結果變化趨勢基本一致，但表達水平變化較大。見表3。

表3 差異表達mRNA的RT-qPCR驗證結果

3 討論

2018年全球新增原發性肝癌患者84.1萬例，死亡78.1 萬例，分居全球惡性腫瘤發病和死亡的第6位和第4 位［11］。肝癌患者即便手術切除腫瘤，多數患者治療后還會復發［12］，且肝癌對化療不太敏感，預后很差［13］。由于單用化療或單用生物靶向藥物治療中晚期肝癌療效不滿意，化療聯合生物靶向藥物治療已成為當前研究的熱點，但是目前有效的分子靶向藥物極少。雖然公認HBV 感染是HCC 發病的主要危險因素，HBx蛋白可以加速肝癌的發展，但其致病的分子生物學機制至今不清楚。因此有必要深入研究HBx 在HCC 發病中的調控機制，尋找核心調控基因及更多有效的分子靶點。

惡性腫瘤是通過不斷選擇對腫瘤細胞有利的遺傳變化并逐漸積累而發生、演變的，惡性腫瘤相關的基因功能變化通常由DNA 序列的改變（染色體易位、缺失、點突變、插入等）引起，而mRNA 作為DNA與蛋白之間遺傳信息傳遞的信使，對其功能的探索一直是生物醫學領域的研究熱點。

隨著大規模測序技術的發展和高通量芯片的應用，越來越多的RNA 分子被發現，有大量的基因組DNA 轉錄成lncRNA，參與調節正常生理過程（如發育、細胞周期調控）和惡性腫瘤的發生發展進程［14-16］。lncRNA 可通過多種分子調控機制，調控DNA 甲基化、組蛋白修飾或染色體重構，參與X 染色體沉默、轉錄激活、轉錄干擾及核內運輸等重要生物過程［17］。現有研究發現，一些lncRNA 經常在與HBV 感染相關的HCC 中特異表達，如MALAT1、UCA1、unigene56159 等，功能研究顯示，這些 ln?cRNA 可以促進 HBV 相關 HCC 的發病和進展［18-20］。而HBx 可以通過調節多種lncRNA 的表達促進HBV相關HCC的發生［21］。因此，深入研究HBx調控的ln?cRNA 表達異常對于闡明HBV 相關HCC 發病機制具有重要意義。

lncRNA 芯片技術是目前用于篩選腫瘤相關lncRNA 和mRNA 的有效方法，可以快速、高效地獲得腫瘤相關特異lncRNA和mRNA表達譜數據，這些差異表達基因可能是某種腫瘤的特征分子標志，并可能成為腫瘤的診斷和治療靶點。本研究采用lncRNA 芯片檢測野生型HBx轉染肝癌Huh7細胞后的mRNA 和lncRNA 表達譜，與轉染空載體的Huh7細胞進行比較，結果發現，差異表達的mRNA 和lncRNA 無論是種類還是數量都較多，有些明顯表達上調，而有些明顯表達下調，散點圖及分層聚類分析結果也證實，HBx-FJ 組的Huh7 細胞存在大量明顯差異表達的mRNA 和lncRNA，提示這些mRNA 和lncRNA 可能參與了HCC 發病的分子調控過程，并且發揮了不同甚至相反的調控功能。我們將篩選出的差異表達mRNA 進行GO 分析，對HBx 調控HCC發生發展過程中可能的生物學過程進行探索，結果顯示，差異表達mRNA 主要涉及離子通道和信號傳遞過程，以及抗原加工和蛋白加工調節過程，這提示離子通道功能的損傷和免疫功能的改變可能是HBx調控HCC 發生的重要因素。通過對差異表達 mRNA 進行 KEGG 通路分析，可以對 HBx 調控HCC 過程中可能涉及的信號轉導通路進行預測，結果顯示，富集程度較高的有轉錄調控、糖代謝、鈣信號轉導等信號通路。根據GO 及KEGG 通路分析結果，并查閱文獻，我們篩選出了6 個關鍵基因ASAP3、CFTR、POSTN、CAMTA1、ESRRG、ROBO1，它們可能參與HBx 對HCC 的調控并發揮重要作用。采用RT-qPCR 法檢測HBx 轉染的Huh7 細胞中的6個關鍵基因，結果顯示，細胞層面的驗證結果與芯片檢測結果的變化趨勢基本一致，證實了芯片結果的可靠性，但是差異mRNA的表達水平變化較大，可能是因為在細胞中的調控因素更加復雜。此外，我們同時進行的另一項lncRNA 芯片檢測篩選出了差異表達基因PDK2，也已通過體外實驗在細胞層面進行了驗證，與芯片結果一致［22］，下一步我們將在人體組織樣本中進行蛋白水平及RNA水平的驗證。

總之，本研究采用lncRNA芯片技術分析HBx調控HCC 發展過程中的相關mRNA 及lncRNA 表達情況，篩選HCC 相關的差異表達基因，為深入探索HBx 調控HCC 的分子機制提供了研究方向，并提出合理策略。