金絲桃苷預處理對腦缺血再灌注損傷小鼠的神經保護作用及機制探討

劉佳佳，張棟旭，曹建文，顏丙春

江蘇省中西醫結合老年病防治重點實驗室 揚州大學醫學院，江蘇揚州225000

腦缺血再灌注損傷是指血流恢復供應后引起的半暗帶區額外損傷，可進一步加重腦功能障礙［1-2］。其病理過程較為復雜，可能涉及血腦屏障（BBB）破壞、氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡及氮化應激等多種機制［3-4］。BBB 是存在于腦組織和血液之間的復雜的生理屏障，由腦內皮細胞及其緊密連接（TJs）、周細胞、星形膠質細胞的腳板和基膜構成，能夠精密控制腦組織和血液之間的物質轉運，在維持中樞神經系統內環境穩態方面起重要作用［5］。研究發現，BBB功能障礙不僅是腦缺血再灌注損傷的核心病理特征，同時也是加重損傷的重要因素［6］。因此，維持BBB正常結構和功能對于防治腦缺血再灌注損傷非常必要。金絲桃苷（HYP）是從天然草本中提取的黃酮醇苷類化合物，具有抗炎、抗血栓及鎮痛等作用，在心血管及神經系統疾病的治療中應用廣泛［7-8］。最新研究表明，在動脈粥樣硬化小鼠模型中，HYP干預可以明顯提高血清NO、eNOS 水平及胸主動脈組織中eNOS 水平，改善血管內皮細胞功能［9］。另有學者發現，50、200、500 μmol/L 的 HYP 可明顯減輕Aβ1-42誘導的腦微血管內皮細胞凋亡，改善BBB 通透性，進而發揮抗阿爾茲海默病作用［10］。2020 年 4 月—2021 年1 月，本研究觀察了HYP 預處理對大腦中動脈栓塞（MCAO）所致的小鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用，并從BBB 方面探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 84 只健康雄性ICR 小鼠（7~8 周，30~35 g）由揚州大學比較醫學中心［SC?CXK（蘇）2012-0004］提供，適應 1 周后投入實驗。小鼠在常規實驗動物室飼養，條件為溫度23 ℃、濕度60%、12 h晝夜交替、自由飲食。整個實驗程序均遵循國際動物福利標準和揚州大學動物倫理委員會要求。HYP購自上海源葉生物公司。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）購自Sigma 公司。三氯乙醛購自阿拉丁公司。ABC 購自VECTOR LABORATORIES公司。兔抗神經元核抗原（NeuN）購自Cell Signal?ing Technology 公司。兔抗膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、兔抗血小板內皮細胞黏附分子蛋白（PECAM）購自Abcam 公司。兔抗緊密連接相關蛋白（ZO1、Claudin5）購自Arigo 公司。內參β-actin 抗體購自聯科生物技術有限公司。羊抗兔IgG 購自Santa Cruz公司。

1.2 動物分組處理及模型制作 將小鼠隨機分為假手術組（Sham 組）、假手術給藥組（HYP 組）、模型組（MCAO 組）和模型給藥組（MCAO+HYP 組），每組21 只 。 HYP 組 、MCAO+HYP 組 術 前 給 予 HYP 50 mg/kg 灌胃（用生理鹽水稀釋配制），每次0.2 mL，持續3 d，末次給藥30 min后行MCAO 手術。Sham 組及MCAO 組給予相同劑量的生理鹽水。MCAO 組及 MCAO+HYP 組采用 MCAO 法制備腦缺血再灌注模型：用含有3%異氟烷的混合氣體麻醉小鼠，沿頸部正中線做一切口，手術鑷分離左側頸總動脈，頸內動脈與頸外動脈；于頸內外動脈分叉處結扎頸外動脈，用血管夾夾閉頸總動脈及頸內動脈，在距頸內外動脈分叉口約4 mm 處用眼科剪作一“V”形切口；將線拴從切口處沿著血管方向插入頸內動脈，待有輕微阻力感表明線拴進入大腦中動脈起始處，用細線輕輕固定線拴；45 min 后拔出線拴，術中監測肛溫，使動物體溫始終保持在（37 ± 0.5）℃。Sham組和HYP組均只分離頸部血管，不進行其他處理。所有實驗動物均于術后1 d處死，每組分別隨機取7只進行TTC染色，7只做組織切片，7只用于提取海馬組織蛋白。

1.3 神經功能缺失評價 再灌注24 h，分別采用Longa評分法和Bederson評分法評價小鼠神經功能。Longa 評分：無神經功能缺損癥狀計0 分；小鼠右前肢屈曲，不能完全伸展計1 分；行走時，小鼠向右側（癱瘓側）轉圈計2 分；行走時，小鼠向右側傾倒計3分；小鼠不能自主行走，喪失意識計4 分。Bederson評分：無行為缺陷計0 分；前肢彎曲（即尾部提升懸吊試驗陽性）計1分；正側向推力試驗顯示側向推力阻力下降計2分；前肢彎曲，沒有循環行為計3分。

1.4 腦梗死體積測定 再灌注24 h 后，腹腔注射10%水合氯醛10 mL/kg，將小鼠完全麻醉后快速處死，取腦組織放置于腦模具中，切成2 mm 厚的冠狀位切片。將腦組織切片置于新鮮配制的2%TTC 溶液中避光染色30 min。用4%多聚甲醛固定切片過夜，隨后進行拍照，用Image Pro Plus6.0 圖像分析軟件分析每個腦片的梗死面積，通過記錄四個腦切片梗死面積之和及腦片厚度計算腦梗死體積。腦梗死體積百分比=（梗死體積/全腦體積）×100%。

1.5 海馬CA1 區組織病理觀察 用PBS 稀釋的0.3% H2O2處理腦組織切片20 min，然后用5% BSA處理腦組織切片30 min。將腦組織暴露于稀釋的兔抗 NeuN（1∶1 000）、兔抗 GFAP（1∶1 000）、兔抗PECAM（1∶500）溶液中，4 ℃過夜。此后，將腦組織依次浸入二抗（1∶250）和ABC溶液中，分別處理1.5 h。DAB 顯色。將染色完畢的組織固定于載玻片上，置于55 ℃烘箱中過夜。經乙醇梯度脫水后，用中性樹脂膠進行封片，顯微鏡下觀察染色結果并照相，計數NeuN、GFAP、PECAM陽性細胞。

1.6 海馬區緊密連接相關蛋白ZO-1、Claudin5蛋白檢測 采用Western blotting 法。再灌注24 h 后，參照“1.4”方法處死小鼠，取腦，分離缺血側海馬組織，用全蛋白提取試劑盒充分裂解，離心后提取上清。根據BCA 蛋白定量試劑盒，統一蛋白質樣品定量（32 μg），用10%SDS-PAGE 電泳進行分離。將分離的蛋白質從凝膠轉移至PVDF 膜。為防止非特異性蛋白結合位點與抗體結合，將膜放置于含0.1%Tween20 的5%脫脂奶粉中封閉90 min。然后分別與兔抗ZO-1、兔抗Claudin5 等一抗在4 ℃冰箱孵育過夜。加入相應的二抗，在室溫下孵育2 h。加入顯影液顯色，在Bio-Rad 自動凝膠成像系統中拍照，以β-actin 為內參。用Image Pro Plus6.0 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統計學方法 采用SPSS24.0 統計軟件。計量資料以表示，多個樣本間的均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組神經功能缺失體征評分及腦梗死體積比較 Sham 組及HYP 組小鼠腦組織無明顯梗死灶及神經功能缺損體征。MCAO 組、MCAO+HYP 組Lon?ga 評分、Bederson 評分、腦梗死體積百分比高于Sham組和HYP組，且MCAO+HYP組Longa評分、Be?derson評分、腦梗死體積百分比低于MCAO組（P均<0.05）。見表1。

表1 各組神經功能缺失體征評分及腦梗死體積百分比比較（）

表1 各組神經功能缺失體征評分及腦梗死體積百分比比較（）

注：與 Sham 組相比，*P<0.05；與 HYP 組相比，#P<0.05；與MCAO組相比，&P<0.05。

組別MCAO+HYP組MCAO組HYP組Sham組Longa評分（分）1.33±0.47*#&2.90±0.29*#Bederson評分（分）1.52±0.50*#&3.24±0.43*#腦梗死體積百分比（%）22.61±3.06*#&46.79±2.28*#0 0 0 0 0 0

2.2 各組海馬CA1 區病理變化及NeuN、GFAP、PECAM 陽性細胞數量比較 Sham 組可見大部分神經元細胞小而密集，星形膠質細胞及血管內皮細胞也呈正常形態。MCAO 組海馬CA1區可見神經元細胞死亡，星形膠質細胞肥大腫脹，突起增多并延長，出現反應型星形膠質細胞，血管內皮細胞活化明顯。MCAO+HYP 組神經元細胞死亡現象、星形膠質細胞和血管內皮細胞變化較MCAO 組明顯減輕。MCAO 組海馬區NeuN 陽性細胞數量低于Sham 組、HYP 組，GFAP、PECAM 陽性細胞數量高于 Sham 組、HYP 組（P均<0.05）。MCAO+HYP 組 NeuN 陽性細胞數量低于HYP組，GFAP、PECAM陽性細胞數量高于 Sham 組（P均<0.05）。MCAO+HYP 組 NeuN 陽性細胞數量高于 MCAO 組，GFAP、PECAM 陽性細胞數量低于MCAO組（P均<0.05）。見表2。

表2 各組海馬區NeuN、GFAP、PECAM 陽性細胞數量比較（個，）

表2 各組海馬區NeuN、GFAP、PECAM 陽性細胞數量比較（個，）

注：與 Sham 組相比，*P<0.05；與 HYP 組相比，#P<0.05；與MCAO組相比，&P<0.05。

PECAM陽性細胞31.00±2.00*&45.00±2.00*#28.33±2.08 25.33±2.08組別MCAO+HYP組MCAO組HYP組Sham組NeuN陽性細胞89.00±3.00#&23.33±3.51*#111.00±8.00 94.33±4.73 GFAP陽性細胞107.33±3.79*&142.67±4.04*#94.00±6.08 90.00±5.00

2.3 各組海馬區ZO-1、Claudin5 蛋白表達比較 MCAO 組海馬區 ZO-1、Claudin5 蛋白表達低于Sham 組、HYP 組（P均<0.05）。MCAO+HYP 組 ZO-1蛋 白 表 達 低 于 Sham 組 、HYP 組（P均 <0.05）。MCAO+HYP 組 ZO-1、Claudin5 蛋白表達高于 MCAO組（P均<0.05）。見表3。

表3 各組海馬區ZO-1、Claudin5蛋白相對表達量比較（）

表3 各組海馬區ZO-1、Claudin5蛋白相對表達量比較（）

注：與 Sham 組相比，*P<0.05；與 HYP 組相比，#P<0.05；與MCAO組相比，&P<0.05。

Claudin5蛋白1.04±0.01&0.36±0.02*#1.06±0.03 1.05±0.02組別MCAO+HYP組MCAO組HYP組Sham組ZO-1蛋白2.06±0.01*#&1.79±0.05*#2.53±0.02*2.20±0.02

3 討論

臨床上治療腦卒中的原則之一是盡早恢復血流再灌注，這將有助于減輕腦缺血損傷。但組織再灌注后也可致腦水腫、腦出血和神經元死亡等不良后果，即為腦缺血再灌注損傷［11］。BBB 功能障礙是缺血性腦卒中的顯著病理特征，主要以TJs 結構紊亂和通透性增高為主，常與預后不良有關。腦缺血再灌注損傷后，氧化應激及炎癥介質等多種因素可損傷內皮細胞，降解TJs，增加BBB 通透性，繼而引起血管源性腦水腫及外周免疫細胞向腦實質浸潤等不良后果，間接加重腦組織損傷［12-13］。因此，如何有效維持BBB 形態和結構完整性已成為腦缺血再灌注損傷治療的關鍵。

HYP 是一種存在于貫葉連翹中的天然產物，具有抗氧化、抗炎及保護心、腦血管等多種生理活性［14-15］。大量研究表明，HYP 具有多重神經保護作用，包括減輕缺血性腦損傷、減輕β-淀粉樣蛋白誘導的神經毒性以及逆轉慢性輕度應激引起的認知功能障礙等［8］。以往的研究表明，12.5、25、50 mg/kg的HYP 可明顯減小腦梗死體積，減輕腦水腫，作用呈劑量依賴性。韓軍等［16］觀察了HYP 對大腦中動脈血管內皮功能的影響，結果表明，HYP 可誘導大腦中動脈血管產生舒張作用及超極化反應，其主要是通過內皮依賴性機制來實現的。但目前對其是否具有調控BBB的作用尚不清楚。

本研究采用MCAO法構建腦缺血再灌注損傷模型，結果顯示，與Sham組及HYP組相比，MCAO組和MCAO+HYP 組出現明顯的梗死灶，神經功能缺損程度增加，海馬CA1 區NeuN 陽性細胞數量明顯減少，提示腦缺血再灌注損傷模型構建成功。與MCAO組相比，MCAO+HYP 組腦梗死體積明顯減小，神經功能缺損體征減輕，NeuN 陽性細胞數量增多。提示HYP 減少缺血再灌注損傷后海馬CA1 區的神經元損傷。

TJs是腦微血管內細胞的連接，具有連接相鄰上皮細胞、選擇性濾過、維持細胞極性以及信號轉導的功能，是維持BBB 完整性和正常功能的重要組成部分［5］。缺血、缺氧引起 TJs 結構及功能受損，提高了BBB的通透性，導致多種血液成分滲出，炎癥細胞和免疫細胞在腦實質中積累，加重腦組織損傷［17］。在TJs 中，Claudin5 和 ZO-1 是反映 BBB 在疾病發病過程中結構變化的敏感指標［8］。有研究表明，烏司他丁通過上調ZO-1 蛋白的表達，從而改善BBB 通透性，最終減輕局灶性腦缺血導致的神經損傷［18］。還有研究結果顯示，通竅活血湯可以通過上調ZO-1、Claudin5 蛋白的表達，減少 TJs 開放，改善 BBB 通透性［19］。 本 研 究 結 果 顯 示 ，MCAO+HYP 組 ZO-1、Claudin5 蛋白表達高于 MCAO 組，提示 HYP 預處理后可明顯增強血管內皮細胞的TJs，HYP 發揮的抗缺血再灌注損傷作用與增加TJs 及維持BBB 完整性密切相關。

此外，星形膠質細胞在維持BBB 完整性和調節其功能方面也起著至關重要的作用。腦缺血再灌注損傷可以刺激星形膠質細胞分泌VEGF-A，激活內皮細胞中的eNOS 信號，導致Claudin-5 的丟失，增加BBB 通透性，使外周免疫細胞更易進入中樞神經系統，加重神經元損傷［20］。星形膠質細胞還能促進小膠質細胞的分化和增殖，增強其吞噬功能，誘導炎癥介質的產生［21］。大量研究表明，包括細胞因子、趨化因子和細胞黏附分子在內的炎癥介質可介導腦缺血再灌注損傷的病理生理過程［21］。本研究結果顯示，MCAO 組GFAP（星形膠質細胞標志物）陽性細胞及PECAM 陽性細胞明顯增多，而HYP 預處理后GFAP、PECAM陽性細胞數量明顯減少，提示HYP發揮的抗腦缺血再灌注損傷作用與抑制星形膠質細胞活化及維持BBB完整性密切相關。

總之，本研究證實HYP 可以減輕腦缺血再灌注誘導的小鼠神經損傷，保護神經功能，且HYP 的作用與維持BBB 的完整性密切相關，但其中具體機制還有待進一步研究探索。