miR-519d對絨毛膜滋養細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響及機制

徐曼，安泓潤，郝媛媛

河北中石油中心醫院產科，河北廊坊065000

妊娠期高血壓疾病（HDCP）是在妊娠期發生的一類高血壓疾病，是妊娠期最常見的并發癥之一［1］。HDCP 最常見的臨床表現為高血壓及蛋白尿，嚴重者會出現心、肝、腎等重要臟器功能衰竭，甚至造成患者死亡。目前HDCP 的發病機制尚未闡明，研究發現，絨毛膜滋養細胞功能異常導致胎盤淺著床和子宮螺旋動脈重塑障礙在HDCP 發病中起重要作用［2-3］，因此有學者提出HDCP 是一種滋養細胞疾病［4］。既往研究表明，微小RNA（miRNAs）與HDCP發病關系密切，可能是HDCP 早期診斷及判斷預后的潛在生物標志物，并且可能成為HDCP 基因治療的有效手段［5］。miRNAs 能夠通過調控絨毛膜滋養細胞增殖、侵襲、遷移等參與HDCP 的發生發展［6］。近期研究發現，miR-519d 在HDCP 患者血漿中的表達水平明顯升高，但其具體作用機制尚不明確［7］。本研究觀察了miR-519d 對絨毛膜滋養細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響，并探討可能的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清購自美國Gibco 公司。miRNA 提取分離試劑盒、cDNA 合成試劑盒、miRNA 熒光定量檢測試劑盒均購自北京天根公司 。 Lipofectamine2000 購 自 美 國 Invitrogen 公司。miR-519d mimics、NC-mimics 和熒光素酶報告基因質粒購自上海吉瑪制藥公司。CCK-8試劑盒購自上海碧云天公司。一抗基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、GAPDH 抗體均購自美國 Santa Cruz 公司。HRP標記的二抗購自武漢博士德公司。8 μm 孔徑的Transwell 小室購自美國 Corning 公司。Matrigel 基質膠購自美國BD Bioscience 公司。熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 細胞培養、分組及轉染 人正常絨毛膜滋養細胞系HTR8/Svneo 購自美國ATCC 公司，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。轉染操作時，將處于對數生長期的HTR8/Svneo細胞以3×105/孔接種于6孔板，待細胞融合度達60%時進行細胞轉染。將HTR8/Svneo 細胞分為實驗組和對照組，用Lipofectamine2000 分別轉染 miR-519d mimics 和 NC-mimics。轉染后 24 h，qRT-PCR 檢測細胞中的miR-519d，結果顯示實驗組和對照組細胞中miR-519d 相對表達量分別為6.19± 0.38、0.97 ± 0.10，實驗組 miR-519d 表達高于對照組（P<0.05），提示轉染效率高。

1.3 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8 實驗。收集兩組細胞，按 5×105/孔接種于 96 孔板，置于 37 ℃、5% CO2的條件下培養，每組設3 個復孔，于轉染后24、48、72、96 h 分別向每孔加入 CCK-8 試劑 10 μL，置于37 ℃、5%CO2條件下繼續孵育4 h，應用酶標儀測定450 nm 處各孔的吸光度（OD）值，表示細胞增殖能力。

1.4 細胞侵襲、遷移能力觀察 采用Transwell 侵襲遷移實驗。首先用Matrigel 基質膠對Transwell 小室的微孔膜進行預鋪膠。取轉染24 h后兩組細胞以無血清培養基重懸制備單細胞懸液，取200 μL 單細胞懸液（含1×104個細胞）加入Transwell 小室上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養基，置入細胞培養箱孵育24 h 后取出小室；完全擦棄殘留在小室膜上表面的細胞，將小室膜下表面的細胞用4%多聚甲醛固定20 min 后染色，高倍顯微鏡下隨機取5 個視野，計算侵襲細胞數目。遷移實驗時不用Matrigel基質膠預鋪，其余步驟同侵襲實驗。

1.5 細胞中MMP-2 蛋白檢測 采用Western blot?ting 法。取轉染24 h 后的兩組細胞，細胞裂解液提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。每孔取40 μg 蛋白樣品上樣，行10%SDS-PAGE，將目的凝膠電轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉于4 ℃條件下封閉膜4 h；分別加入一抗 MMP-2（1∶800）和 GAPDH（1∶1 000），4 ℃搖床孵育過夜，TBST溶液洗滌3次；加入HRP標記的二抗（1∶5 000），37 ℃孵育1 h 后，TBST 溶液洗滌3 遍；加入ECL 試劑顯影，曝光后，凝膠成像儀拍照，Quality One 軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH 條帶灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.6 miR-519d 與MMP-2 的靶向調控關系分析 采用雙熒光素酶報告基因檢測法。收集HTR8/Svneo細胞接種于24 孔板中，用Lipofectamine2000 將野生型熒光素酶報告基因質粒MMP-2WT 和突變型熒光素酶報告基因質粒MMP-2MUT 分別單獨轉染HTR8/Svneo 細 胞 ，同 時 將 NC-mimics 和 miR-519d mimics 單獨分別轉染HTR8/Svneo 細胞，轉染24 h 后收集細胞，加入細胞裂解液裂解細胞，應用熒光素酶檢測試劑盒檢測細胞的相對熒光素酶活性。

1.7 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件。計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞增殖能力比較 實驗組轉染后24、48、72、96 h 后細胞增殖能力均低于對照組（P均<0.05）。見表1。

表1 兩組細胞增殖能力比較（）

表1 兩組細胞增殖能力比較（）

注：與對照組相比，*P<0.05。

組別實驗組對照組增殖能力96 h 0.45±0.05*0.87±0.07 24 h 0.24±0.03*0.34±0.03 48 h 0.29±0.04*0.45±0.05 72 h 0.35±0.06*0.62±0.07

2.2 兩組細胞侵襲、遷移能力比較 實驗組和對照組穿膜侵襲細胞數分別為（21±8）、（68±18）個，穿膜遷移細胞數分別為（26±9）、（88±16）個，實驗組穿膜侵襲、遷移細胞數均少于對照組（P均<0.05）。見圖1。

圖1 兩組細胞Transwell遷移、侵襲實驗結果

2.3 兩組細胞中MMP-2 蛋白表達比較 實驗組和對照組細胞中MMP-2蛋白相對表達量分別為0.42±0.11、1.03 ± 0.12，實驗組細胞中 MMP-2 蛋白相對表達量低于對照組（P<0.05）。見圖2。

圖2 兩組細胞中MMP-2蛋白表達情況（Western blotting法）

2.4 miR-519d 與MMP-2 的靶向調控關系 雙熒光素酶活性檢測結果顯示，共轉染MMP-2 WT 與miR-519d mimics、共轉染 MMP-2 WT 與 NC-mimics 的細胞的相對熒光素酶活性分別為0.52±0.09、1.03±0.06，前者相對熒光素酶活性低于后者（P<0.05）。共 轉 染 MMP-2 MUT 與 miR-519d mimics、共 轉 染MMP-2 MUT 與NC-mimics 的細胞的相對熒光素酶活性分別為1.04 ± 0.03、1.02 ± 0.07，兩者差異無統計學意義。miR-519d 能夠靶向結合MMP-2 的3'非編碼區。

3 討論

HDCP 是產科常見疾病之一，相關研究報道其發病率為6%~10%［8］，常常發生在孕期至產后3 個月。胎盤在孕婦與胎兒物質交換中發揮重要作用，HDCP 孕婦在胎盤娩出后，癥狀常常能夠迅速得到緩解，因此眾多學者認為胎盤功能異常特別是絨毛膜滋養細胞功能異常在HDCP 的發生進展中起著極其重要的作用［9］。HDCP 孕婦胎盤組織中滋養細胞增殖、侵襲及凋亡異常是已知的HDCP 的主要發病機制之一。研究認為，孕婦胎盤滋養細胞侵襲能力減弱、增殖不良導致胎盤淺著床，引起胎盤缺血缺氧性損傷，繼而導致 HDCP［10］。

近期研究顯示，胎盤組織中miRNA 異常表達可能是許多妊娠并發癥（包括HDCP）發病的重要原因之一。HDCP 患者胎盤組織中存在著大量異常表達的miRNA，通過影響絨毛膜滋養細胞功能參與HDCP 的發病［11］。絨毛膜滋養細胞增殖、侵襲、遷移能力異常會影響子宮螺旋動脈的重塑，從而造成胎盤淺著床，參與 HDCP 的發生進展［12］。ZHONG 等［13］的研究發現，miR-1233 在HDCP 患者胎盤組織表達顯著升高，并且異常升高的miR-1233 能夠抑制滋養細胞的增殖及侵襲能力。ZHOU 等［14］發現，子癇前期孕婦血清和胎盤組織中均存在miR-384 異常高表達，miR-384 能夠通過調控PTBP3 影響滋養細胞的增殖、侵襲、遷移能力從而參與子癇前期的發生。miR-519d 是近期在惡性腫瘤中研究較多的熱點 miRNA 家族成員之一［15-16］。有學者發現，HDCP患者血漿miR-519d 水平明顯升高［7］，提示 miR-519d可能在HDCP 的發生發展中起著重要作用，但其在HDCP 中的作用機制尚不清楚。研究發現，miR-519d 能夠通過影響腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移等生物學行為參與惡性腫瘤的發病［17-18］。絨毛膜滋養細胞在免疫逃逸、增殖、侵襲、遷移等方面的特性與惡性腫瘤細胞具有很強的相似性［19］，因此我們推測，miR-519d 在HDCP 發病中的作用可能與其對滋養細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響有關。本研究發現，升高 HTR-8/SVneo 細胞中 miR-519d 表達后，細胞的增殖能力明顯降低，侵襲、遷移能力明顯下降，驗證了上述推測。

MMP-2 是一類能夠降解細胞外基質的蛋白水解酶，是滋養細胞合成分泌期間降解細胞外基質的關鍵酶之一。腫瘤相關研究已證實，MMP-2 能夠通過MRPK-ERK、HSP90 等多種信號通路促進腫瘤細胞的侵襲和遷移。近期較多研究發現，HDCP 患者不僅胎盤組織中MMP-2 表達明顯降低，其血清MMP-2 水平亦明顯降低，MMP-2 表達下降可導致滋養細胞功能異常，從而參與 HDCP 發病［20-22］。JIN等［23］研究發現，上調MMP-2 表達能夠明顯提高滋養細胞增殖、侵襲及遷移能力。miRNA 通常通過調控下游靶基因影響機體復雜的信號通路，參與細胞功能調控。有研究發現，miR-519d能夠調控MMP-2參與惡性腫瘤的發病及化療耐藥［24-25］。本研究發現，上調滋養細胞中miR-519d表達能夠明顯抑制MMP-2 蛋白的表達，并且我們通過雙熒光素酶活性實驗發現，轉染miR-519d mimics能夠顯著抑制野生型基因報告載體MMP-2 WT 的熒光素酶活性，而不能改變突變型基因報告載體MMP-2 MUT 的熒光素酶活性，進一步說明miR-519d能夠靶向結合MMP-2的3'非編碼區，提示miR-519d 在HDCP 發病中的作用機制可能與其對MMP-2的靶向調控有關。

綜上所述，miR-519d 高表達能夠抑制絨毛膜滋養細胞增殖、侵襲、遷移能力，其機制可能與調控MMP-2表達有關。上述研究結果為明確HDCP的發病機制及探索生物靶向治療方案提供了新的線索。