癸源煎活性成分分析及其治療卵巢儲備功能下降機制探討

王月嬌，徐蓮薇，劉小菲，趙莉

上海中醫藥大學附屬龍華醫院婦科，上海200032

卵巢儲備功能下降（DOR）指卵巢內卵母細胞數量減少和（或）質量下降，同時伴有抗苗勒管激素（AMH）水平降低、竇卵泡計數減少、患者生育能力下降［1］。DOR 病因復雜，與遺傳因素、自身免疫因素、醫源性因素、感染、內外環境失調等有關［2-8］。患者可有卵巢顆粒細胞異常增殖及凋亡，卵泡募集、選擇及發育失常，卵泡池過度耗竭［9-14］。中醫婦科學認為本病屬于“月經類病”，與腎精不足、胞宮失養有關，整體論治、充養胞宮對改善DOR 患者卵巢儲備功能有一定作用［15-20］。癸源煎為上海市名老中醫李祥云根據海派陳氏婦科思想，結合臨床經驗創立。本病由腎虛血瘀所致，通過癸源煎補腎活血、陰陽雙調保護卵巢功能。癸源煎由熟地黃、枸杞子、肉蓯蓉、仙靈脾、菟絲子、雞血藤、香附七味藥物組成。前期臨床對照研究發現，癸源煎對于減輕DOR 患者癥狀、升高血清AMH、提高妊娠率有一定作用［21］。本研究通過高效液相色譜法（HPLC）測定癸源煎的主要成分，并通過網絡藥理學研究癸源煎保護卵巢功能的潛在作用靶點和通路，為明確癸源煎藥物成分、進一步探索癸源煎保護卵巢儲備功能的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 熟地黃（產地河南，批號200323）購自上海養和堂中藥飲片有限公司。仙靈脾（產地甘肅，批號20200061004）、香附（產地海南，批號20200061203）購自上海華浦中藥飲片有限公司。肉蓯蓉（產地內蒙古，批號20061203）購自上海華濟藥業有限公司。菟絲子（產地內蒙古，批號200615）、枸杞子（產地寧夏，批號200515）、雞血藤（產地廣西，批號200615）購自上海虹橋中藥飲片有限公司。對照品淫羊藿苷（批號110737-201516）、兒茶素（批號110877-201604）、金絲桃苷（批號111521-201809）、α-香附酮（批號110748-201513）、甜菜堿（批號110894-201604）來自中國食品藥品檢定研究院。松果菊苷（批號5967）、地黃苷D（批號8323）購自詩丹德生物技術有限公司。流動相中甲醇、乙腈、甲酸、磷酸為色譜純。高效液相色譜儀（型號1260）購自安捷倫科技有限公司。數控超聲波清洗器（型號KQ-500DE）購自昆山市超聲儀器有限公司。電子天平（型號BSA124S）購自賽多利斯集團。旋轉蒸發儀（型號RE-300A）購自上海亞榮生化儀器廠。冷凍干燥機（型號FD-1C-50）購自上海精其公司。

1.2 實驗溶液配制 癸源煎：熟地黃15 g、仙靈脾30 g、枸杞子15 g、菟絲子 15 g、肉蓯蓉15 g、雞血藤30 g、香附10 g，雙煎后過濾得300 mL水煎液，?20 ℃冰箱冷凍72 h后置于?80 ℃真空冷凍干燥機48 h，取凍干樣品精細研磨，過篩后取3 g藥粉加入50%甲醇50 mL，稱定重量，浸泡30 min，超聲處理40 min（功率250 W，頻率35 kHz），冷卻后再次稱量，加50%甲醇補足減失的重量，搖勻靜置后取上清液，濾過，取續濾液，即得。單一成分對照品溶液：精密稱取地黃苷D 1.46 mg、松果菊苷3.94 mg、金絲桃苷1.17 mg、淫羊藿苷2.34 mg、兒茶素2.37 mg、甜菜堿3.39 mg、α-香附酮0.17 mg分別加入甲醇20 mL，即得。

1.3 癸源煎水提液有效成分檢測 采用HPLC 法。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。兒茶素流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）。地黃苷D、α-香附酮流動相：甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B）。淫羊藿苷、甜菜堿流動相：乙腈（A）-水（B）。金絲桃苷流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）。松果菊苷流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）。波長分別為202、203、249、270、185、360、330 nm。柱溫 30 ℃，流速 1 mL/min，進樣量10 μL。

1.4 癸源煎治療DOR網絡藥理學機制分析

1.4.1 癸源煎化學成分及靶點篩選 在TCMSP 數據庫中檢索癸源煎的組成藥物：熟地黃、仙靈脾、枸杞子、菟絲子、肉蓯蓉、雞血藤、香附，收集其化學成分及靶點信息，設定成分篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%、藥物相似度（DL）≥0.18，截止日期為2020 年11 月30 日，對所有結果進行匯總并刪除重復，獲得活性成分及靶點。

1.4.2 DOR 致病基因篩選 以“diminished ovarian reserve”為關鍵詞，在 GeneCards、NCBI 基因數據庫、OMIM 數據庫進行人類基因檢索，截止日期為2020年11月30日，將上述數據庫的基因合并刪除重復之后，得到卵巢儲備功效下降的潛在相關基因。

1.4.3 核心基因篩選 將篩選出的癸源煎藥物靶點、DOR 疾病靶點輸入Venny2.1 軟件，得到共有靶點并繪制韋恩圖，將共有靶點作為藥物作用于疾病的預測靶點進行通路富集分析，輸入String 數據庫進行蛋白質相互作用（PPI）網絡構建，并導入Cysto?scap3.6.0 軟件，通過Network Analyzer 工具進行拓撲 分 析 ，以 degree、betweenness centrality、average shortest path length 和 closeness centrality 為參數，通過degree 排序，選取得分大于平均分的基因作為關鍵靶點，并將前20 個靶點使用R3.6.3 軟件進行圖片繪制。

1.4.4 核心基因功能分析 將藥物、疾病共有靶點進行GO 分析中的生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞組分（CC）富集，并進行KEGG 通路富集，分別引用String 數據庫，篩選校正P≤0.05 的項目，繪制柱狀圖和氣泡圖。將構建好的PPI 網絡導入Cyto?scape3.7.2軟件中，通過MCODE模塊進行基因簇的分析，篩選癸源煎治療DOR的關鍵基因。

2 結果

2.1 癸源煎的有效成分 通過HPLC 檢測癸源煎水提液有效成分，發現癸源煎水提物中可較好地分離出金絲桃苷、甜菜堿、松果菊苷，地黃苷D、淫羊藿苷、兒茶素有一定表達，α-香附酮未被檢測出。

2.2 癸源煎治療DOR的網絡藥理學機制

2.2.1 癸源煎化學成分及其靶點 通過TCMIP 數據庫對癸源煎的復方中藥分別檢索后，熟地黃獲得2 個化學成分，27 個靶點；香附獲得19 個化學成分，205個靶點；仙靈脾獲得23個化學成分，202個靶點；枸杞子獲得45個化學成分，176個靶點；雞血藤獲得24 個化學成分，122 個靶點；肉蓯蓉獲得7 個化學成分，159個靶點；菟絲子得到11個化學成分，108個靶點。匯總并刪除重復后共得到癸源煎的藥物靶點330個。

2.2.2 DOR 致病基因 GeneCards 數據庫中共獲得1 052 條DOR 相關基因，NCBI 基因數據庫獲得28個基因，OMIM 數據庫獲得145 個基因，匯總并刪除重復之后，共得到DOR治病相關基因1 178個。

2.2.3 癸源煎治療DOR 的潛在靶點及功能分析通過Venny2.1 軟件將篩選出的癸源煎藥物靶點、DOR 疾病靶點取交集，獲得共有靶點151 個，通過PPI 網絡構建篩選出60 個重要靶點，將前20 個靶點作為關鍵基因，使用R3.6.3 軟件進行可視化關聯。其中 AKT1 連接節點 112 個，IL-6 連接節點 106 個，MAPK3 連接節點 99 個，VEGFA、TNF 連接節點 93個，EGFR、CASP3、MAPK1、EGF、MAPK8 連接節點80~90 個，主要涉及細胞凋亡及增殖、血管生成、氧化應激、能量代謝、炎癥反應。見表1。MCODE 聚類分析得到5個基因簇和4個核心基因，核心基因分別為 IL-4、EGFR、MYC、VCAM1。GO 分析中，BP 分析結果顯示，靶點基因涉及糖脂代謝、炎癥反應、類固醇類激素結合、氧化應激等過程；MF 分析結果顯示，共有靶點在細胞核及細胞膜均有分布；CC 分析結果顯示，靶點基因主要與核受體活性配體激活轉錄因子活性、細胞因子受體結合、類固醇激素受體活性、磷酸酶結合、兒茶酚胺結合、支架蛋白結合、信號受體激活等功能有關。KEGG 通路分析共富集得到129 條通路，主要涉及糖尿病并發癥信號通路、HIF1信號通路、TNF 信號通路、C 型凝集素受體信號通路、FoxO信號通路、T細胞受體通路、P13K-AKT信號通路、內分泌抵抗、病毒相關疾病（皰疹病毒、巨細胞病毒、麻疹病毒、EB病毒）、鉑類耐藥等。

表1 癸源煎治療DOR的核心靶點篩選結果

3 討論

對于DOR 的治療，西醫一般采用行為干預、雌孕激素補充等方法，中醫藥辨證施治，從臟腑、氣血、陰陽調節，療效較好。癸源煎由全國名老中醫李祥云教授根據海派陳氏婦科理論結合自身經驗創立，其中熟地黃、枸杞子大補肝腎之陰，菟絲子、肉蓯蓉、仙靈脾溫補腎中真陽，雞血藤、香附理氣活血，諸藥合用，共奏滋陰益陽、生精化癸之功效。癸源兩字有兩重含義，一指本方可助腎中陰陽平衡、真元滋長，化生精氣，充養天癸，使天癸生化有源則沖任胞宮得養，生殖功能可復；二指本方可滋補肝腎陰精，而乙癸同源，補肝益腎，相輔相成，可助陰血互化、精血有源、女子生理功能旺盛。前期臨床對照研究發現，以癸源煎為基礎方，隨證加減，對于減輕DOR 患者臨床癥狀、調節月經周期、改善血清基礎性激素水平、增強卵巢儲備功能、提高早期妊娠率有較好療效；并且，小鼠實驗也顯示，癸源煎對DOR 小鼠也有較好的改善卵巢功能的作用［22］。

根據《藥典》，菟絲子、枸杞子、肉蓯蓉、熟地黃、仙靈脾、雞血藤、香附主要有效成分分別為金絲桃苷、甜菜堿、松果菊苷、地黃苷D、淫羊藿苷、兒茶素、α-香附酮。本研究據此為單一對照品通過HPLC 法測定癸源煎水提液活性成分，其中金絲桃苷、甜菜堿、松果菊苷可實現較好地分離，地黃苷D、淫羊藿苷、兒茶素表達量較少，水提液中未檢測出α-香附酮。由此，可證實癸源煎水提液中菟絲子、枸杞子、肉蓯蓉等補腎藥含量較高，補益腎中陰陽是癸源煎調補卵巢功能的關鍵。色譜圖中地黃苷D、淫羊藿苷、兒茶素峰面積較小，α-香附酮未有顯示，可能與癸源煎提取方法、流變相設置有關。

本研究通過網絡藥理學方法，篩選出癸源煎治療DOR的20個關鍵靶點，其中AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、TNF、TGF、EGFR、CASP3、MAPK1、EGF、MAPK8 為關鍵基因，涉及細胞凋亡及增殖、血管生成及穩態、糖脂能量代謝、氧化應激、炎癥反應、類固醇類激素結合等。共有靶點在核膜及核內均有分布，主要功能與核受體活性配體激活轉錄因子活性、細胞因子受體結合、類固醇激素受體活性、磷酸酶結合等有關。

近年來關于PI3K/AKT/mTOR信號通路與DOR的關系研究較多。PI3K/AKT/mTOR 信號通路被認為參與原始卵泡的激活，影響顆粒細胞的增殖分化、并可在卵泡發育的各個階段中起到調節作用。這與PI3K/AKT/mTOR 參與細胞增殖、分化、凋亡等過程相關。PI3K 失活或水平降低，可導致細胞增殖分化停滯、細胞自噬及凋亡加劇，在生殖細胞中則能抑制原始卵泡生長發育、誘導顆粒細胞凋亡，促進卵泡閉鎖［23］。有研究認為，PI3K/AKT/mTOR 與下丘腦—垂體—卵巢軸相互關聯，激活PI3K/AKT/mTOR 可促進雌激素釋放，促進卵巢顆粒細胞增殖，有助于卵泡生長發育；而過多的促卵泡生成素則可抑制PI3K/AKT/mTOR通路，使卵泡發育失常。

IL 相關通路影響炎癥反應、細胞增殖、血管形成而參與DOR 的發生發展。近年來相關研究集中在IL-6、IL-10、IL-17等細胞因子，并以IL-6為研究熱點。有學者認為，IL-6作為多功能的細胞因子，具有促進細胞增殖、分化的作用，并可促進異常血管生成［24］。在 DOR 免疫機制相關研究中，IL-6 及相關通路為研究重點，IL-6可激活MAPK及PI3K，促進細胞異常增殖，導致卵泡池過早耗竭［25］。

MAPK 通路參與細胞的增殖、分化、轉移、凋亡，對于卵巢功能有重要作用。MAPK 家族成員主要包括 ERK1/2、JNK、p38、ERK5 等，參與卵巢顆粒細胞的增殖及凋亡，并對卵泡的生長發育起到重要的調控作用。有研究認為，MAPK 信號通路異常是導致卵巢功能衰退甚至卵巢早衰的重要原因，且與絕經過程有關［26］。

TGF-β 可直接參與生殖細胞的增殖、分化、凋亡，在卵巢功能相關信號通路中起到重要作用。TGF-β 復合物可與Ⅱ型受體直接結合，激酶磷酸化并激活Ⅰ型受體，實現信號轉導，其下游通路主要分為Smad蛋白介導的經典通路及非Smad蛋白介導的信號通路。研究發現，發育良好的竇卵泡及成熟卵泡的卵泡核內、卵巢顆粒細胞膜上，TGF-β1及Smad2、Smad3 蛋白表達均有高表達。通過激活TGF-β 的經典通路，可以促進卵母細胞發育及顆粒細胞增殖，對于卵巢功能的發揮有重要作用［27］。

HIF1 信號通路參與氧化應激、糖脂代謝、血管生成、細胞增殖，是DOR 及卵巢早衰相關通路的研究新熱點。HIF1 可以調節下游VEGF 表達，調節卵巢組織中的血管生成。HIF1 還可調節血管舒縮，其功能異常可導致卵巢組織血流供應不足，發生卵泡異常凋亡［28］。

綜上所述，癸源煎治療DOR 的潛在機制可能與中藥復方影響AKT、IL-6、VEGF、HIF1、TGF、MAPK等通路，調節卵巢顆粒細胞增殖與凋亡，改善卵泡發育，調控相關激素分泌，促進受體結合，減輕卵巢組織氧化應激及炎癥反應，增加卵巢血管生成并恢復卵巢血供有關。網絡藥理學分析結果證實了中藥復方多靶點治療DOR 的優勢，并為進一步通過基礎實驗驗證其具體機制提供了思路和理論依據。