中心復(fù)合設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方延胡索微乳凝膠貼膏中揮發(fā)油的提取工藝

高俊玲王慧凱王濱王振偉李新新宮凱凱黃瑩潔滿玉清,李燕

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺 264003；2 濱州市中醫(yī)院 山東 濱州 256600; 3 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部 山東 濱州 256603

復(fù)方延胡索微乳凝膠貼膏處方來源于臨床驗(yàn)方，由延胡索、當(dāng)歸、桂枝、雞血藤組成。在臨床應(yīng)用時(shí)將四味藥打成細(xì)粉，熱水調(diào)敷，現(xiàn)用現(xiàn)配，具有活血養(yǎng)血、行氣、活絡(luò)止痛等功效，常用于骨關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)疼痛等的治療，療效肯定，但因制作程序較繁瑣，在一定程度上限制了該驗(yàn)方的應(yīng)用范圍，目前尚無相關(guān)制劑的研究，本課題旨在以該驗(yàn)方為基礎(chǔ)，制作方便臨床使用的新劑型，以擴(kuò)大應(yīng)用范圍，并為骨關(guān)節(jié)炎癥患者提供新的治療藥物。該方中當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv．) Diels的干燥塊根，揮發(fā)油是當(dāng)歸的主要藥效成分，其在當(dāng)歸中含量約占1%；當(dāng)歸揮發(fā)油又包括亞丁基苯酞、丁烯基酞內(nèi)酯、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯等[1]；桂枝為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl.的嫩枝，含揮發(fā)油類成分，具溫陽通脈，助陽化氣之功效，主要活性成分是揮發(fā)油，而揮發(fā)油中桂皮醛是主要的抗炎活性物質(zhì)[2]，可減輕RA小鼠模型軟骨的炎癥與降解，降低淋巴細(xì)胞中氮自由基含量，抑制血清中核因子活化的T細(xì)胞C1(NFATc1)，TNF-α，碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)，鈣依賴型蛋白酶的mRNA(m-Calpain)的表達(dá)[3]。綜上所述，當(dāng)歸、桂枝揮發(fā)油均與抗炎、止痛的藥理作用密切相關(guān)，因此需要對兩種飲片單獨(dú)提取揮發(fā)油。

效應(yīng)面法(response surface methodology，RSM)是集數(shù)學(xué)和設(shè)計(jì)最佳組合等技術(shù)為一體的一種綜合應(yīng)用，與均勻、正交設(shè)計(jì)相比，精度更高，預(yù)測性更好，近年來被廣泛用于工藝優(yōu)化[4]。本文采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法以加水量、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間作為考察因素，揮發(fā)油收率、蒿本內(nèi)酯、桂皮醛含量作為優(yōu)化指標(biāo)優(yōu)選提取工藝，旨在提高制劑提取水平，為制劑工藝與產(chǎn)品開發(fā)提供有效、可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1100液相色譜儀(Agilent Technologies1260 Infinity Ⅱ)；BS110S型精密電子天平(瑞士Mettler Toledo儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)

1.2 試藥 藁本內(nèi)酯對照品(上海源葉生物科技有限公司，含量98%，批號：B20492)；桂皮醛對照品(上海源葉生物科技有限公司，含量98%，批號：B21481)；甲醇(色譜純，天津盛世薩格科技有限公司)，色譜用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法的建立

2.1.1 溶液的配制

2.1.1.1 藁苯內(nèi)酯對照品溶液的制備 精密稱量藁苯內(nèi)酯對照品6.01 mg于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對照品儲備液，低溫、避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.1.2 桂皮醛對照品溶液的制備 精密稱量桂皮醛對照品3.18 mg于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對照品儲備液，低溫、避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.1.3 供試品溶液的制備 取按規(guī)定方法制得的混合揮發(fā)油適量，石油醚萃取，無水硫酸鈉干燥，加甲醇超聲溶解，定容于10 mL棕色容量瓶中，低溫、避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.1.4 陰性對照液的制備 按上面制備方法分別制備不含當(dāng)歸、桂枝、當(dāng)歸和桂枝的陰性溶液。

2.1.2 色譜條件[4]色譜柱為ThermosC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(55∶45)；流速為1 mL/min；檢測波長為285 nm，進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為30℃。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取蒿本內(nèi)酯和桂皮醛對照品溶液0.2、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，各置50 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得系列濃度對照品溶液，各取對照品溶液20 μL，進(jìn)樣，測定峰面積。以峰面積(Y)對進(jìn)樣濃度(X)進(jìn)行線性回歸，蒿本內(nèi)酯在2.404～60.010 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=3.720 4×104X+24.530(R2=0.999 9)；桂皮醛在1.272～31.800 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=2.164 3×104X-41.739(R2=0.999 9)。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取不同濃度蒿本內(nèi)酯、桂皮醛對照品溶液，在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣5次，分別測得峰面積的RSD為1. 22%、1.16%，表明方法精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取混合揮發(fā)油共5份，在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，測定蒿本內(nèi)酯含量的RSD 1. 09%，桂皮醛含量的RSD 1.20%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的混合揮發(fā)油1.0 g，精密稱定，共6份，分別精密加入蒿本內(nèi)酯對照品4.50 μg、桂皮醛2.40 μg，在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算出平均加樣回收率為99.1%，RSD 1.1%，表明方法準(zhǔn)確度良好。見圖1。

A 蒿本內(nèi)酯對照品；B桂皮醛對照品；C 混合對照品；D樣品；E 桂皮醛陰性；F 蒿本內(nèi)酯陰性；G雙陰性溶液。

2.2 提取方法優(yōu)選 揮發(fā)油測定器(中國藥典規(guī)格，安徽天長市康博實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，DJ600-2型電子天平(成都倍塞克儀器表研究所)；電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)，藥典篩(紹興市上虞圣超儀器設(shè)備有限公司)。

當(dāng)歸飲片(產(chǎn)地甘肅岷縣)、桂枝飲片(產(chǎn)地廣西)，石油醚(天津市天力化學(xué)儀器有限公司)，二甲苯(天津市恒興化學(xué)儀器有限公司)，飲片均購于河北省安國中藥飲片有限責(zé)任公司，并經(jīng)山東省濱州市中藥鑒定專家王君教授鑒定，當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸的干燥根，桂枝為樟科植物肉桂干燥嫩枝，均符合《中國藥典》[5]2020年版一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定，其他試劑均為分析純。

2.2.1 吸水率的考察 將飲片粉碎至過20目篩，稱取當(dāng)歸、桂枝兩味中藥飲片各100 g，放入同一燒杯中，加入水的體積記為A1，待浸潤至全部透心，過濾出剩余的水A2，并計(jì)算吸水率(表1)。

表1 飲片吸水率的考察

2.2.2 揮發(fā)油提取方法 以《中國藥典》2020 年版第四部揮發(fā)油測定法乙法(2204 通則)為指導(dǎo)測定揮發(fā)油含量，并計(jì)算揮發(fā)油收率。揮發(fā)油收率=揮發(fā)油體積/飲片質(zhì)量×100%

2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以揮發(fā)油中蒿本內(nèi)酯和桂皮醛在揮發(fā)油中各自所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)、揮發(fā)油收率為CQAs，考察相關(guān)因素變化時(shí)CQAs相應(yīng)的變化趨勢。

2.3.1 粉碎粒度 稱取當(dāng)歸、桂枝各100 g，補(bǔ)足吸水率1.67倍，浸泡2 h，提取8 h，考察粉碎粒度分別過10、24、50、65目篩時(shí)對CQAs的影響。揮發(fā)油收率隨著粉碎粒度的增加先增大，到一定的粉碎粒度后呈下降趨勢(圖2)。

A 粉碎粒度對蒿本內(nèi)酯、桂皮醛含量的影響；B 粉碎粒度對揮發(fā)油收率的影響。

2.3.2 加水量 稱取當(dāng)歸、桂枝粗粉(過24目篩，下同)各100 g，補(bǔ)足吸水率1.67倍，浸泡2 h，提取8 h，考察加水量分別為5、6、7、8、9、10、11倍時(shí)，揮發(fā)油收率的變化。結(jié)果顯示：加水量在5～10倍區(qū)間內(nèi)蒿本內(nèi)酯、桂皮醛含量、揮發(fā)油收率隨著加水量的增加而增加，超過10倍以上變化不明顯，見圖3。因此，初步確定考察加水量在5～10倍區(qū)間內(nèi)對CQAs的影響。

2.3.3 浸泡時(shí)間 稱取當(dāng)歸、桂枝粗粉各100 g，補(bǔ)足吸水率1.67倍，加水量為8倍，提取8h，考察浸泡時(shí)間分別為0、30、60、90、120、150、180 min時(shí)CQAs的變化。結(jié)果表明：浸泡時(shí)間在0～120 min區(qū)間內(nèi)，揮發(fā)油收率隨著浸泡時(shí)間的延長而增加，超過120 min變化不明顯，蒿本內(nèi)酯、桂皮醛在揮發(fā)油中的含量比例變化較小，見圖4，因此考察浸泡時(shí)間為60～120 min內(nèi)對CQAs的影響。

A 浸泡時(shí)間對蒿本內(nèi)酯、桂皮醛含量的影響；B 浸泡時(shí)間對揮發(fā)油收率的影響。

2.3.4 提取時(shí)間 稱取當(dāng)歸、桂枝各100 g，補(bǔ)足吸水率1.67倍，8倍加水量，浸泡2 h，考察提取時(shí)間在0～11 h內(nèi)揮發(fā)油收率的變化。結(jié)果顯示：提取時(shí)間在0～10 h內(nèi)，揮發(fā)油收率隨提取時(shí)間的延長而明顯增加，超過10 h，揮發(fā)油收率增加不明顯，而蒿本內(nèi)酯、桂皮醛在揮發(fā)油中的含量在達(dá)到一定的提取時(shí)間后呈下降趨勢，提示相關(guān)成分在長時(shí)間的加熱后可能導(dǎo)致分解或異構(gòu)化(圖5)。因此，考察提取時(shí)間在0～10 h內(nèi)對揮發(fā)油收率的影響。

A 提取時(shí)間對蒿本內(nèi)酯、桂皮醛含量的影響；B 提取時(shí)間對揮發(fā)油收率的影響。

預(yù)實(shí)驗(yàn)及單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，藥粉過粗，浸泡時(shí)間過長，有效成分溶出度較少，時(shí)間成本相對增加；然而藥粉過細(xì)，也會出現(xiàn)新的問題，如有效成分溶出度減少，或者油細(xì)胞被破壞而導(dǎo)致最終出油率降低，在合理范圍內(nèi)，CQAs變化不明顯，結(jié)合文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選取通過24目篩為最終粉碎粒度。浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間對影響揮發(fā)油收率影響較大，因此確定以上三個(gè)因素作為CPPs，并確定各自的合理區(qū)間。

2.4 中心復(fù)合設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法 根據(jù) Central Composite 中心復(fù)合設(shè)計(jì)的原理，參考單因素試驗(yàn)結(jié)果，以加水量(A)、提取時(shí)間(B)和浸泡時(shí)間(C)三個(gè)對揮發(fā)油收率影響較大的因素為自變量，以蒿本內(nèi)酯(Y1)、桂皮醛含量(Y2)以及揮發(fā)油得率(Y3)為優(yōu)化指標(biāo)，進(jìn)行3因素5水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，用代碼-α、-1、0、1、α(α=1.732)表示，當(dāng)歸、桂枝揮發(fā)油水蒸氣蒸餾提取工藝因素水平(表2)，當(dāng)歸、桂枝揮發(fā)油提取工藝中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果(表3)。

表2 當(dāng)歸、桂枝揮發(fā)油水蒸氣蒸餾提取工藝因素水平

表3 當(dāng)歸、桂枝揮發(fā)油提取工藝中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5 模型擬合與方差分析 運(yùn)用 Design-Expert 8.0.6版軟件將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以蒿本內(nèi)酯含量(Y1)、桂皮醛含量(Y2)、揮發(fā)油收率(Y3)對考察因素(A、B、C)進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，經(jīng)F檢驗(yàn)，采用 ANOVA 分析效應(yīng)面的回歸參數(shù)，方差分析結(jié)果見表4，從表中可以看出，影響揮發(fā)油中蒿本內(nèi)酯和桂皮醛含量的主要因素為提取時(shí)間，但在加熱至一定時(shí)間后后二者含量均會降低，可能由于二者均熱不穩(wěn)定[6-7]有關(guān)，加水量與提取時(shí)間對揮發(fā)油收率的影響顯著，浸泡時(shí)間為其不顯著因素，三者均為模型顯著(P<0.001)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說明所得方程與實(shí)際情況擬合度良好，有較大可信度，預(yù)測性較好，可以利用該模型分析預(yù)測最佳工藝條件。

表4 回歸方程顯著性檢驗(yàn)

擬合方程如下：

Y1=38.83+0.134A+7.17×10-2B+1.356C-1.25×10-2AB-5×10-3AC-8.25×10-2BC-3.825×10-2A2-1.159×10-2B2-1.733C2；

Y2=23.53+5.312×10-2A+3.589×10-2B+1.99C-7.5×10-3AB-4.25×10-2AC-3.75×10-2BC-3.296×10-1A2-2.546×10-1B2-1.785C2;

Y3=0.4092+2.754×10-2A+5.261×10-3B+3.425×10-2C+1.875×10-3AB-1.437×10-2AC-5.625×10-3BC-1.802×10-2A2-5.516×10-3B2-8.849×10-3C2。

若以P<0.05為有顯著性差異，則三個(gè)模型均具顯著性差異，根據(jù)各模型分析結(jié)果來看，A、C對Y1具有顯著性影響；C、A2、B2、C2對Y2具有顯著性影響；A、C、AC、A2、C2對Y3具有顯著性影響。利用 Design-Expert8.0.6軟件的Analysis模塊繪制因素間交互作用有顯著性差異的因素對考察指標(biāo)：即A、C對Y1；A、C對Y3的三維效應(yīng)面圖和等高線圖，見圖6。

圖6 加水量(A)和提取時(shí)間(C)對揮發(fā)油得率(Y3)的曲面圖和等高線

2.6 工藝優(yōu)化與預(yù)測 綜合考慮各影響因素及圖1最優(yōu)區(qū)域，將各考察因素A、B、C及優(yōu)化指標(biāo)Y1、Y2、Y3上限設(shè)為盡可能大，根據(jù)軟件的Optimization 模塊疊加各模型所得的最佳條件范圍得到最終的最優(yōu)處方：加水量：9.75倍，浸泡時(shí)間為95.23 min，提取時(shí)間：7.91 h，預(yù)測在此條件下制得的揮發(fā)油含蒿本內(nèi)酯39.20%、含桂皮醛23.30%，揮發(fā)油收率為0.413%，為方便工業(yè)生產(chǎn)，可將各最優(yōu)條件調(diào)整為加水量10倍，浸泡時(shí)間100 min，提取時(shí)間8 h。

稱取當(dāng)歸、桂枝各100 g混勻，共三份，以最優(yōu)條件提取揮發(fā)油，分別測定蒿本內(nèi)酯、桂皮醛含量、揮發(fā)油得率，結(jié)果如表5所示，三次試驗(yàn)的實(shí)際值與預(yù)測值誤差均小于0.05，預(yù)測性好，RSD值較小，工藝重現(xiàn)性好。

表5 當(dāng)歸、桂枝最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證性試驗(yàn)

中心復(fù)合設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)選復(fù)方延胡索微乳凝膠貼膏揮發(fā)油提取工藝準(zhǔn)確性高，可較好地描述加水量、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間三因素對蒿本內(nèi)酯、桂皮醛含量及揮發(fā)油收率之間的函數(shù)關(guān)系，所建模型得到的工藝參數(shù)合理可靠。

3 討論

鐘立甲[8]等運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)研究得出當(dāng)歸揮發(fā)油對炎癥過程機(jī)體代謝紊亂發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。徐鋒[9]等通過查閱文獻(xiàn)總結(jié)得出，桂枝揮發(fā)油的抗炎作用較好，其分子機(jī)制與干預(yù)Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)、抑制核因子-κB(NF-κB)信號通路有關(guān)；桂枝揮發(fā)油還可抑制Toll樣受體2(TLR2)的表達(dá)及蛋白酪氨酸激酶(PTK)、前列腺素E2的活性，其中桂皮醛可抑制環(huán)氧酶-2(COX-2)和一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)。揮發(fā)油的含量多少對最終制劑的藥效有較大影響，因此選用先進(jìn)、預(yù)測準(zhǔn)確的軟件優(yōu)選當(dāng)歸、枝混合混發(fā)油的提取工藝尤為重要。

預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)對飲片粉碎粒度進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)藥粉過粗，浸泡時(shí)間過長，有效成分溶出度較少，時(shí)間成本相對增加；然而藥粉過細(xì)，也會出現(xiàn)新的問題，如有效成分溶出度減少，或者油細(xì)胞被破壞而導(dǎo)致最終出油率降低，結(jié)合文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選取通過20目篩為最終粉碎粒度。

本實(shí)驗(yàn)當(dāng)歸、桂枝混合提取的揮發(fā)油中同時(shí)存在重油、輕油，預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)分別考察過采取輕油裝置加二甲苯、輕油裝置不加二甲苯、重油裝置加二甲苯、重油裝置不加二甲苯四種裝置提取揮發(fā)油，結(jié)果均不利于揮發(fā)油的體積讀取和收集，為減小測量誤差，準(zhǔn)確記錄揮發(fā)油體積，最后確定參照《中國藥典》2020年版第四部揮發(fā)油測定法乙法(2204通則)進(jìn)行試驗(yàn)，讀數(shù)前處理如下：將收集的揮發(fā)油使用石油醚(30-60)萃取，無水硫酸鈉脫水干燥，用移液管吸取揮發(fā)油進(jìn)行測量、計(jì)數(shù)，為優(yōu)選最佳提取工藝做基礎(chǔ)。