直腸癌患者放射治療前后IL-17和IL-23的表達(dá)及意義

菅金波 劉 鵬 張魯燕 倪 娜 王曉樂 寧方玲

1 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科 山東 濱州 256603；2 陽(yáng)信縣中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)一科 山東 濱州 251800；3 濱州市人民醫(yī)院腫瘤三科 山東 濱州 256610；4 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室 山東 濱州 256603

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是世界上第三大最常見的癌癥類型，也是癌癥死亡的主要原因[1]，其發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多步驟的過程，不同CD4+T淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子調(diào)控失衡是關(guān)鍵因素[2]，血清中細(xì)胞因子的變化可能是結(jié)直腸癌變的早期事件。

IL-17作為Th17細(xì)胞的特征性分泌因子，可通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和抗腫瘤反應(yīng)及促進(jìn)腫瘤血管形成發(fā)揮調(diào)控腫瘤的作用[3]。IL-23同樣是Th17細(xì)胞分泌的重要炎性因子，是維持Th17細(xì)胞表型所必須的[4]。研究表明，IL-17/IL-23軸在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了作用[5]，在結(jié)直腸癌中，IL-23和IL-17的表達(dá)升高與預(yù)后差和快速轉(zhuǎn)移進(jìn)展有關(guān)[6]。臨床工作中，放射治療是直腸癌常用的治療方法，為探討IL-17/IL-23軸在直腸癌放射治療中的作用，本研究通過ELISA法檢測(cè)放射治療前后直腸癌患者外周血清IL-17和IL-23水平變化，分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)而對(duì)放射治療在直腸癌免疫病理中的作用有進(jìn)一步的了解。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年06月至2017年12月在濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行根治性手術(shù)切除的直腸癌患者，共24例，男性18例，女性6例，年齡35～72歲，平均(56.6±10.6)歲。所有患者均有完整的資料且經(jīng)病理確診，采用UICC/AJCC TNM分期系統(tǒng)(第8版)進(jìn)行分期，所有入組患者均接受IMRT調(diào)強(qiáng)放射治療。所有患者均簽署了知情同意書，研究獲得濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本收集 所有患者在放射治療前1周和放射治療后1周清晨空腹采集靜脈血4～5 mL，EDTA抗凝4℃3 000 r/min離心10 min，分離血清后存放于-80℃低溫冰箱保存，檢測(cè)時(shí)室溫下融化并在2 h內(nèi)測(cè)定IL-17和IL-23的含量，避免反復(fù)凍融。

1.3 放射治療策略 放射治療計(jì)劃由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的具有副高以上職稱的放射治療科醫(yī)師設(shè)計(jì)，采用調(diào)強(qiáng)放射治療技術(shù)(intensity modulated radiation therapy, IMRT)，熱塑膜固定體位，強(qiáng)化CT模擬掃描，掃描層間距5 mm，在Varian Eclipse DX計(jì)劃系統(tǒng)勾畫靶區(qū)，照射機(jī)器采用VARIAN直線加速器(型號(hào)：TYRLOGY)，放射治療處方劑量：2.0 Gy/f，5 f/1 w，總劑量DT：50 Gy/25 f/5 w，確保所有患者擺位誤差在本單位可控范圍內(nèi)。

1.4 IL-17和IL-23的檢測(cè) 人IL-17A ELISA試劑盒(Cat,# m1027425-C)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；人IL-23 ELISA試劑盒(CK-E10357)購(gòu)自上海語(yǔ)純生物科技有限公司。本研究采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)檢測(cè)IL-17和IL-23的含量。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD)值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)線性回歸曲線，按照曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。具體操作過程：①包被緩沖液(0.05 M，pH9.5，碳酸鹽緩沖液)按1∶100 稀釋包被抗體，每孔100 μL至96孔板，封板膜封板，4℃冰箱過夜；②傾棄包被液，洗滌液洗板3次，每次≥300 μL，最后用吸水紙去除孔內(nèi)剩余液體；③加封閉液(1%FBS)≥200 μL/孔，封膜室溫孵育1小時(shí)；④洗滌液洗板同②，洗滌5次；⑤按照說明制備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品；⑥加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品每孔100 μL，封膜室溫孵育2小時(shí)；⑦洗滌液洗板同②，洗滌5次；⑧1∶400 稀釋第二抗體，每孔加100 μL，封膜后室溫孵育1 小時(shí)；⑨洗滌液洗板同(2)，洗滌5次；⑩每孔加入1∶2 000 稀釋辣根過氧化物酶(HRP)100 μL，封膜后室溫孵育半小時(shí)；洗滌液洗板同(2)，洗滌5次；每孔加100 μL顯色劑(TMB)，室溫后避光孵育30 分鐘；每孔加50 μL 終止液(4NH2SO4)，30 分鐘內(nèi)置酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)(450 nm)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子濃度，所有數(shù)據(jù)均為雙復(fù)孔所得結(jié)果的平均值。

1.5 隨訪 采用電話和門診結(jié)合的隨訪方式。從2017年06月隨訪至2020年06月，中位隨訪時(shí)間為21個(gè)月(6～36個(gè)月)，無失訪病例，隨訪期內(nèi)死亡17例。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌患者外周血清IL-17和IL-23水平與臨床病理特征的關(guān)系 直腸癌患者放射治療前血清中IL-17水平與患者的年齡、性別、脈管癌栓、神經(jīng)受侵、T分期無關(guān)(P>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)(P<0.05)；直腸癌患者放射治療前血清IL-23水平與患者的年齡、性別、脈管癌栓、神經(jīng)受侵、T分期、分化程度無關(guān)(P>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 直腸癌患者外周血IL-17和IL-23水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 直腸癌患者放射治療前后血清IL-17和IL-23水平及腫瘤標(biāo)記物的變化 經(jīng)放射治療后，直腸癌患者血清IL-17、IL-23水平均較放射治療前降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血清中腫瘤標(biāo)記物CEA和CA199放射治療后均較放射治療前下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 直腸癌患者血清IL-17和IL-23水平及腫瘤標(biāo)記物放射治療前后比較

2.3 直腸癌患者放射治療前后血清IL-17和IL-23相關(guān)性分析 應(yīng)用Spearman法分析直腸癌患者放射治療前外周血清IL-17和IL-23含量存在相關(guān)性(r=0.493，P<0.05)，放射治療后外周血清IL-17和IL-23含量同樣存在相關(guān)性(r=0.482，P<0.05)。

2.4 ROC曲線分析IL-17和IL-23對(duì)直腸癌的診斷價(jià)值 依據(jù)ROC曲線分析，血清IL-17和IL-23水平可以準(zhǔn)確有效的診斷直腸癌，血清中IL-23和IL-17水平可用于判斷直腸癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，血清IL-23水平的ROC曲線下面積大于血清IL-17水平，在預(yù)測(cè)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中血清IL-23更有意義；但是在分化程度中，血清IL-17水平的ROC曲線下面積大于血清IL-23水平，因此IL-17在直腸癌分化程度預(yù)測(cè)中更有意義，見表3。

表3 IL-17和IL-23對(duì)直腸癌患者分化及程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)參數(shù)的影響

2.5 生存分析 采用Kaplan-Meier生存曲線、Log-Rank時(shí)序檢驗(yàn)對(duì)可能影響直腸癌預(yù)后的因素進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)受侵、IL-23水平、IL-17水平與患者預(yù)后相關(guān)，將有顯著影響的4項(xiàng)因素納入Cox回歸模型多因素分析，結(jié)果顯示神經(jīng)受侵和IL-23水平是直腸癌無進(jìn)展生存的獨(dú)立預(yù)后因素，見表4、圖1、圖2。

圖1 直腸癌患者IL-23低表達(dá)組和高表達(dá)組生存曲線

圖2 直腸癌患者無神經(jīng)受侵組和有神經(jīng)受侵組生存曲線

表4 無進(jìn)展生存影響多因素的Cox回歸模型分析

3 討論

炎癥被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生進(jìn)展的一個(gè)重要因素，IL-17和IL-23作為一類促炎癥細(xì)胞因子，既可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[7]，也可抑制腫瘤細(xì)胞的再生[8]。其中，IL-17主要由活化的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌產(chǎn)生。研究表明，IL-17可以通過自分泌或旁分泌的方式激活腸上皮和內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生VEGF促進(jìn)血管生成，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和遷移力[9]，也可通過增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞或通過促進(jìn)CD4+T和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)至腫瘤組織發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[3]。與正常腸組織相比，IL-17在人的結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)增加，可通過增加上皮細(xì)胞的存活表現(xiàn)出促腫瘤作用，往往提示這部分患者預(yù)后不良[10]。研究還發(fā)現(xiàn)，IL-17在宮頸癌[11]、肺癌[12]、皮膚癌[13]等多種腫瘤組織中均表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤再生、增強(qiáng)腫瘤侵襲能力的作用。與IL-17相似，IL-23被認(rèn)為在多種免疫炎癥性疾病和惡性腫瘤的發(fā)展中起重要作用，其功能主要由IL-23R實(shí)現(xiàn)[14]。有學(xué)者認(rèn)為，IL-23主要通過表達(dá)IL-23R的髓系細(xì)胞在結(jié)直腸炎相關(guān)的結(jié)直腸癌中發(fā)生重要的作用[15]。Cocco C等[16]報(bào)道，過表達(dá)IL-23可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而在瘤微環(huán)境中，IL-23的水平則是增高的[17]，往往提示預(yù)后差。研究表明，IL-23可以誘導(dǎo)IL-17和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，隨著腫瘤的進(jìn)展，Th17細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，IL-23及其復(fù)合物水平也逐漸升高[18]。

慢性炎癥在惡性腫瘤的發(fā)展中扮演著重要的角色，IL-17/IL-23軸在炎性腸癌的發(fā)展中的作用已被證實(shí)。研究顯示，結(jié)直腸癌患者預(yù)后差可能與IL-17/IL-23軸的高表達(dá)有關(guān)[19]，而隨著化學(xué)療法、放射治療等治療模式的廣泛開展，一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IL-17/IL-23軸參與了腫瘤治療中耐藥機(jī)制的發(fā)生過程[20]。例如，IL-17通過抑制促凋亡信號(hào)的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌和結(jié)腸癌化學(xué)療法耐藥性的發(fā)展[21]。資料表明，結(jié)直腸癌患者外周血中IL-17水平與腫瘤的進(jìn)展和腫瘤負(fù)荷的增加呈正相關(guān)[22]。而關(guān)于IL-17/IL-23軸在血清中的表達(dá)及36其與放射治療關(guān)系研究報(bào)道較少，我們采用ELISA法檢測(cè)直腸癌患者血清的IL-17和IL-23表達(dá)，并分別檢測(cè)兩者在放射治療前后的水平。結(jié)果顯示，外周血清IL-17水平與直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)，IL-23水平只與直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與其他病理指標(biāo)無關(guān)，而隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和分化程度的增加，IL-17和IL-23在外周血清中的表達(dá)水平也增高，可以認(rèn)為IL-17/IL-23軸不僅與直腸癌的發(fā)展有關(guān)，也參與了直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。經(jīng)過放射治療后，血清IL-17和IL-23水平均較放射治療前下降，這與Zhong W J等[23]報(bào)道的放射治療促進(jìn)IL-17分泌是不同的，可能與我們此項(xiàng)研究選擇病例數(shù)較少有關(guān)。通過相關(guān)性分析顯示，放射治療前和放射治療后血清IL-17和IL-23均具有正相關(guān)性，但是相關(guān)性不高，提示IL-17/IL-23軸可能參與了直腸癌進(jìn)展的病理免疫過程。通過ROC曲線分析顯示，血清IL-17和IL-23水平可以有效的預(yù)測(cè)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度，可以將其作為直腸癌診斷的指標(biāo)。經(jīng)過Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示IL-23水平和神經(jīng)受侵可能是直腸癌獨(dú)立的預(yù)后因素。

總之，檢測(cè)IL-17和IL-23水平對(duì)直腸癌的診斷和預(yù)后具有一定的臨床意義。當(dāng)然，本研究存在納入病例數(shù)較少，沒有同時(shí)檢測(cè)組織學(xué)中相關(guān)指標(biāo)的變化趨勢(shì)等不足，但是隨著更深入的研究，IL-17/IL-23軸也許可能成為治療直腸癌的新靶點(diǎn)。