蛋白激酶CI的表達與胰腺癌的相關性分析

冉德園 于運亮

濱州醫(yī)學院煙臺附屬醫(yī)院檢驗科 山東 煙臺 264100

胰腺癌是消化系統(tǒng)中惡性程度最高的腫瘤之一，在所有消化道腫瘤中預后最差， 5年生存率僅約6%，其診斷與治療極具挑戰(zhàn)性，整體防治效果甚微[1]。手術是目前治療胰腺癌的最佳方式，但80%以上的胰腺癌患者在確診時已無法手術切除治療。隨著基礎研究尤其是基因測序技術的不斷發(fā)展，數(shù)據(jù)挖掘整合分析正逐漸成為癌癥分析的重要手段，這使得闡明胰腺癌的病因和發(fā)病機制成為可能，為胰腺癌的防治帶來了一線曙光。

蛋白激酶C(protein kinase C，PRKC)是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的成員，其中PRKC同工酶在細胞增殖、分化、凋亡和血管生成等過程中起著重要作用。PRKCI是蛋白激酶C家族的一員，已被證實是一種癌基因[2]。研究顯示PRKCI高表達的癌癥患者其預后不良，PRKCI與腫瘤組織的侵襲、轉(zhuǎn)移等行為密切相關[3-5]。利用基因靶向治療或藥物可抑制PRKCI的表達，進而阻止腫瘤進程[6-8]。

目前研究證實PRKCI與前列腺癌[9]、肝癌[10]、卵巢癌[11]等癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關，但PRKCI是否參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展尚有待進一步研究。本研究采用Oncomine、基因表達譜動態(tài)分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA)、人類蛋白表達圖譜(the human protein atlas，HPA)、腫瘤免疫在線評估資源(tumor immune estimation resource，TIMER)等數(shù)據(jù)庫綜合分析PRKCI在胰腺癌中的表達及其與患者預后的關系，分析與PRKCI相互作用的蛋白，并初步分析在胰腺癌中PRKCI的表達與免疫細胞浸潤的相關關系，以期為進一步研究PRKCI在胰腺癌的診斷、治療及其預后提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫 Oncomine數(shù)據(jù)庫是癌癥基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺，可用于比較癌癥和正常組織的差異表達分析。在本文中Oncomine數(shù)據(jù)提取設定的篩選條件為：Gene，PRKCI；Analysis type，cancer VS normal analysis；Cancertype，Pancreatic cancer；Data type，mRNA；Sample type，Clinical specimen；臨界值設定條件，P<0.000 1，fold change>2.0，gene rank=top 10%(https://www.oncomine.org/)。通過以上設定因素分析PRKCI基因在腫瘤組織中的表達。

1.2 GEPIA數(shù)據(jù)庫 GEPIA數(shù)據(jù)庫包含9 736個腫瘤樣本和8 587個正常組織樣本，涉及33種惡性腫瘤，是基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫計算得出標準RNA測序數(shù)據(jù)的在線應用數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)。GEPIA生存分析檢索條件為：Gene，PRKCI；Methods，Overall survival(OS)/Disease Free Survival (RFS)；Group cutoff，Median；Hazards Ratio(HR)，Yes；95% Confidence Interval，No；Axis Units，Months；Datasets Selection，PAAD。利用GEPIA “Stage plot”模塊搜索PRKCI基因在不同病理分期胰腺癌組織中的表達情況，應用LogRank檢驗分析PRKCI的表達差異。

1.3 HPA數(shù)據(jù)庫 HPA數(shù)據(jù)庫(https://www.Proteinatlas.org)通過采用高通量生產(chǎn)特異性蛋白抗體和免疫組化技術、基于抗體的成像技術、蛋白質(zhì)組學、組織芯片等技術將人體組織和細胞的蛋白質(zhì)圖譜結(jié)合起來供研究使用。本研究使用HPA分析正常胰腺組織和胰腺癌組織中PRKCI的蛋白表達差異，根據(jù)需要篩選PRKCI的抗體ID為HPA026574。

1.4 CCLE和EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫 腫瘤細胞系數(shù)據(jù)庫(Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE)(www.Belistor.org/CCLE)匯總了近1 000個腫瘤細胞系的mRNA表達、基因突變、DNA拷貝數(shù)等信息供研究者使用。歐洲生物信息研究所(The European Bioinformatics Institute，EMBL-EBI)是一個大型生物信息公共數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/gxa/home)，可提供免費生物信息資源，如蛋白質(zhì)組學、基因表達、轉(zhuǎn)錄組學、系統(tǒng)生物學等。本研究首先使用CCLE檢測了PRKCI在各種腫瘤細胞系的表達概況，隨后又通過EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫中的“Gene expression”模塊進一步研究PRKCI在40種胰腺癌細胞系中的表達情況。

1.5 String-DB數(shù)據(jù)庫 String-DB是可以預測的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的在線檢索數(shù)據(jù)庫，在本研究中鍵入“PRKCI”，物種選擇人類，置信度選擇“Medium=0.400”，相互作用數(shù)目最大數(shù)選擇為10。

1.6 TIMER數(shù)據(jù)庫 TIMER在線數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)可用于研究腫瘤組織中免疫細胞(B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)的浸潤情況，可量化分析免疫細胞浸潤比例，還可檢測體細胞拷貝數(shù)突變與免疫浸潤之間的關系等等。TIMER共有7個功能模塊供研究者選擇，本研究選取“Gene”模塊研究在胰腺癌中PRKCI的表達與免疫細胞浸潤之間的關系，選取“Correlation”模塊研究PRKCI基因與其他基因的相關性。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0以及GraphPad Prism 7軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。正常胰腺和胰腺癌組織之間PRKCI表達的差異采用t檢驗。PRKCI基因表達與患者生存期的關系采用 Kaplan-Meier 模型進行生存分析。PRKCI基因與其他基因的相關性采用Spearman相關系數(shù)進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PRKCI mRNA在胰腺癌組織中的表達 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析PRKCI mRNA在人體各種腫瘤組織中的表達水平，結(jié)果顯示,Oncomine共收集了455項不同類型的研究，其中證明PRKCI mRNA在腫瘤和癌旁正常組織中的表達水平差異具有統(tǒng)計學意義的研究共25項(圖1A)。隨后根據(jù)前文的篩選條件，在Oncomine中篩選得出10個研究對象，對以上10個對象分析發(fā)現(xiàn)，PRKCI mRNA在胰腺癌組織中呈高表達(圖1B)。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫顯示PRKCI mRNA在胰腺癌組織中高表達

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析PRKCI mRNA在33種腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達水平，結(jié)果顯示：PRKCI mRNA在胰腺癌中呈高表達(P<0.01)，與Oncomine分析結(jié)果相一致(圖2)。

圖2 GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示PRKCI mRNA在胰腺癌組織中高表達

2.2 PRKCI蛋白在胰腺癌中的表達 HPA數(shù)據(jù)庫顯示：PRKCI蛋白在3例正常胰腺組織中均呈低表達(圖3A)，而12例胰腺癌組織中有5例顯示PRKCI蛋白呈中表達(圖3B)，4例顯示PRKCI蛋白呈低表達,3例無PRKCI表達。綜上所述，PRKCI蛋白在胰腺癌中的蛋白表達水平高于正常胰腺組織，但結(jié)果需要進一步驗證。

圖3 HPA數(shù)據(jù)庫顯示PRKCI蛋白在胰腺癌組織中的表達(抗體HPA026574)

2.3 PRKCI mRNA在胰腺癌細胞系中的高表達 通過CCLE研究PRKCI mRNA在各種腫瘤細胞系中的表達發(fā)現(xiàn)：PRKCI mRNA在胰腺癌細胞系中表達相對較高(圖4A)。隨后本研究通過EMBL-EBI生物信息學網(wǎng)站進一步驗證胰腺癌細胞系中PRKCI mRNA的表達，結(jié)果顯示,40種胰腺癌細胞系中的PRKCI mRNA均呈高表達(圖4B)。

圖4 PRKCI mRNA在胰腺癌細胞系中高表達

2.4 PRKCI的表達與胰腺癌患者預后的相關性 使用GEPIA分析PRKCI mRNA的表達水平與33種腫瘤患者的總生存期和無病生存期的相關性，結(jié)果顯示,在胰腺癌患者中PRKCI mRNA表達越高的患者其總生存期越短(P<0.05)(圖5A和5C)；在胰腺癌患者中，PRKCI mRNA表達越高的患者其無病生存期越短(P<0.05)(圖5B和5D)。另外，GEPIA顯示PRKCI mRNA與胰腺癌患者的分期顯著相關(P<0.01)(圖5E)。

圖5 PRKCI基因的表達與胰腺癌患者總生存期、無病生存期呈負相關

2.5 與PRKCI相互作用的蛋白網(wǎng)絡 利用String在線網(wǎng)站分析PRKCI與其上下游基因關系，結(jié)果顯示PRKCI的PPI富集的P<0.001，相互作用節(jié)點數(shù)為11個。在PPI網(wǎng)絡中，與PRKCI相互作用(score>0.4)的基因有CDC42、NUMB、SQSTM1、LLGL2、PDPK1等(圖6)，主要參與絲裂原信號轉(zhuǎn)導、細胞遷移、細胞極性、炎癥反應等生理過程。

圖6 PRKCI與其上下游基團的關系

2.6 胰腺癌中PRKCI的表達與腫瘤純度及免疫細胞浸潤的相關性 腫瘤周圍微環(huán)境中存在的免疫細胞亞群主要包括B細胞、T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。利用TIMER數(shù)據(jù)庫研究在胰腺癌組織中6種免疫細胞與PRKCI mRNA的表達是否相關，結(jié)果顯示，PRKCI mRNA的表達與CD8+T細胞呈弱正相關關系，而與CD4+T細胞呈負相關關系。PKRCI的表達與腫瘤細胞的純度、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞無明顯相關性。以上結(jié)果表明，在CD4+T細胞中，PRKCI隨著細胞比例的減少而增高，預示著PRKCI在腫瘤微環(huán)境中可能起到了促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。另外，本研究檢測了在胰腺癌中PRKCI的表達與PD-1、PD-L1和CTLA4基因的相關關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRKCI與PD-1無明顯相關，而與PD-L1和CTLA-4呈負相關(圖7)。

圖7 PRKCI的表達與腫瘤細胞純度、免疫細胞浸潤(7A)、及與PD-1、PD-L1和和CTLA-4基因(7B)的相關性

3 討論

PRKCI作為蛋白激酶C家族的一員，與多種腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移、耐藥性和預后相關。研究證實在肺鱗狀細胞癌中，癌基因PRKCI和SOX2可通過PRKCI-SOX-HHAT信號通路促使腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12]。PRKCI在卵巢透明細胞癌中表達上調(diào)，且與腫瘤的遷移和侵襲有關，PRKCI可作為卵巢透明細胞癌的潛在治療靶點[11]。本研究發(fā)現(xiàn)PRKCI在胰腺癌組織和細胞系中均呈高表達，且PRKCI高表達的胰腺癌患者其總生存期和無病生存期均低于低表達的患者，且PRKCI的表達水平與胰腺癌患者的臨床病理分期顯著相關，PRKCI很可能作為癌基因促進胰腺癌的進展。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤組織可誘導免疫細胞分化障礙和功能失調(diào)，促進腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等過程。其中，腫瘤免疫治療是通過重新啟動并維持免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的識別和殺傷，恢復機體正常的抗腫瘤免疫反應，從而控制與清除腫瘤的一種新的治療方法。研究證實，腫瘤細胞表面表達的PD-L1能夠與CD4+T細胞表面受體PD-1結(jié)合，抑制T細胞活化增殖。本研究發(fā)現(xiàn)PRKCI的表達與PD-L1、CTLA1基因的表達呈弱負相關關系，預示PRKCI可能直接或間接作用于PD1-PDL1途徑或CTLA-4分子促進CD4+T細胞活比增殖。眾所周知，免疫療法旨在利用人體自身的免疫系統(tǒng)對抗腫瘤細胞，腫瘤中浸潤的免疫細胞最有可能作為藥物靶標來提高患者的生存率，深入了解PRKCI在胰腺癌中與免疫細胞尤其是CD4+T細胞的作用及其作用機制必將對胰腺癌的診斷和治療產(chǎn)生深遠的影響。