鑒定鼻咽癌候選基因及信號通路的研究

郭恒臣，孫永剛，劉國良

（1.海倫市人民醫院耳鼻喉科，黑龍江 海倫 152300；2. 海倫市中醫院麻醉科，黑龍江 海倫 152300）

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種獨特的、由鼻咽黏膜病變引起的頭頸部鱗狀細胞癌，多發生于咽隱窩。鼻咽癌與頭頸部腫瘤具有相似的細胞或組織譜系，但其發生機制與頭頸部腫瘤不同。鼻咽癌相對不常見。2018 年，全球約有129000 例鼻咽癌新發病例，占新發確診癌癥病例總數的0 ～7%[1]。鼻咽癌具有獨特的發病地理格局。超過70%的鼻咽癌新發病例發生在東亞和東南亞。在中國，鼻咽癌的年齡標準化發病率為30/10 萬[2]。而在美國和歐洲，鼻咽癌的年齡標準化發病率不到1/10 萬[1,3]。男性鼻咽癌的發病率高于女性。鼻咽癌的發生與愛潑斯坦- 巴爾病毒（EBV）感染、遺傳易感性和環境因素等多種危險因素相關[4-7]。與未分化癌相關鼻咽癌的發展需要EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）的參與。鼻咽癌的發生機制一直沒有得到很好的闡述。近年來，國際科研機構對腫瘤疾病進行大規?；虮磉_譜研究[8]，獲得了一定數量的腫瘤學基礎研究數據。整合生物信息學方法與表達譜分析技術分析處理這些臨床研究數據，可以更好地探討鼻咽癌發生、發展的基礎機制，為鼻咽癌的醫學研究提供有價值的線索。

1 資料與方法

1.1 鼻咽癌基因表達數據集

從Home-GEO-NCBI 網 站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） 下 載 鼻 咽 癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）組織Expression profiling 表達數據。實驗樣品由121 例樣本組成（GSE12452、GPL570 實驗平臺的41 例樣本，于2019 年3 月25 日 公 開；GSE13597、GPL96 實 驗平臺的28 例樣本，于2018 年8 月10 日公開；GSE53819、GPL6480 實驗平臺的36 例樣本，于2019 年8 月1 日公開；GSE64634、GPL570 實驗平臺的16 例樣本，于2019 年3月25 日公開；合計86 例腫瘤樣本，35 例對照樣本）。

1.2 整合高通量功能基因表達原始數據進行分析

用Bioconductor 軟件包及GEO2R/GEO query 處理四個芯片數據。用經典t檢驗確定差異表達基因（differentially expressed genes,DEGs），以統計學差異顯著（P＜0.05）和[logFC]|> 1 作為篩選標準定義DEGs[9]。

1.3 基因和信號途徑富集分析

綜合應用多個數據庫分析候選DEGs，進行DAVID 基因注釋，同時使用Kegg pathway（http：//www.genome.jp/kegg）、Reactome（http：//www.reactome.org）、Panther（http://www.pantherdb.org/）進行基因（GO）分析和信號通路途徑富集分析[8]。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI）、模塊分析和重要候選基因的整合及途徑鑒定

應 用 數 據 庫STRING（http ：//string-db.org）、 制 圖Cytoscape 軟件繪制蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI）[10]，分析鼻咽癌分析結果DEGs 的作用圖譜。同時，使用蛋白作用分析器插件計算節點蛋白值。

2 結果

2.1 鼻咽癌中DEGs 的鑒定

在NCBI-GEO 免費的微陣列/ 基因譜數據庫查詢鼻咽 癌 組 織 芯 片（GSE12452、GSE13597、GSE53819 和GSE64634）及對照樣本檢測數據。分別從對應表達譜數據集中提取1374 個、1524 個、1471 個、3367 個DEGs。與對照正常組織樣本相比，從四組芯片中共鑒定114 個共表達DEGs（見圖1），其中包括38 個上調基因和76 個下調基因（見表1）。

圖1 鑒別GSE12452、GSE13597、GSE53819 和GSE64634 中114 個DEGs

表1 同正常對照鼻咽癌組織相比，從四個數據集鑒定出114 個DEGs

2.2 鼻咽癌DEGs 的GO 分析

使用多個數據庫聯合進行DEGs 的GO 分析，將DEGs分為三個功能組：分子功能組、生物過程組和細胞成分組（見圖2 A）。在生物過程組中，上調表達基因主要集中在蛋白質轉運的負調控、細胞對營養水平的反應、細胞胞吐過程中，而下調表達基因主要與蛋白酶體蛋白分解代謝過程的正調控、蛋白酶體泛素依賴蛋白分解過程的調控密切相關；在分子功能組中，上調表達基因主要富集于蛋白質結合、糖胺聚糖結合的過程中，而下調基因同樣與蛋白質結合、非共價相互作用相關；在細胞成分組中，上調基因主要富集在細胞部分，而下調的基因主要富集在細胞質、細胞膜、細胞外細胞器。多數DEGs 與蛋白質結合及代謝、細胞骨架蛋白、酶活性反應顯著相關。詳見圖2 B 和表2。

圖2 鼻咽癌中DEGs 的基因本體分析（A）經GO 分析將DEGs 分為3 組（即分子功能組、生物學過程組和細胞成分組）；（B）經GO 分析居前30 位的DEGs

表2 上調及下調DEGs 的GO 分析

2.3 DEGs 的信號通路富集分析

使 用KEGG PATHWAY、Reactome、Panther 和Gene Ontology 在線數據庫進行DEGs 功能和信號通路富集分析。DEGs 主要富集于癌癥中的轉錄失調、細胞粘附分子（CAMs）、代謝途徑及PI3K-Akt 信號傳導途徑（見圖3、表3）。

圖3 NPC 中DEGs 功能和信號通路富集

表3 NPC 中DEGs 信號通路富集分析

2.4 DEGs 的蛋白質-蛋白質相互作用網絡

用鑒定出的114 個DEGs（36 個上調基因和78 個下調基因）繪制蛋白質- 蛋白質相互作用（protein-protein interaction, PPI）網絡圖，PPI 網絡圖包含114 個節點和453 作用連線。在114 個節點中，36 個中心節點基因被識別，過濾標準設定為：相互作用關系大于10 標準為中心節點，即每個節點具有10 個以上的連接或相互作用。36 個節點基因 是FN1、CD19、C3、CXCL10、CLU、PROM1、CD22、MMP3、CR2、SCGB1A1、MEF2C、PAX5、PIGR、GAD1、PLAU、MAD2L1、MSLN、VCAN、DST、HOXA10、LTF、MS4A1、MUC16、PTGDS、ANG、SPAG6、TCL1A、TEKT2、TSPAN8、ATP12A、BANK1、CR1、DNAI1、KLF2、KRT7 和NRXN1。同時，從PPI 網絡中篩選構建2 個亞信號通路網絡，使用MCODE 進行進一步分析。通路富集分析亞網絡A 由19 個節點和50 個相互作用關系組成（見圖4A），主要與癌癥中的轉錄失調、TNF 信號通路、NF-κB信號通路、Toll 樣受體信號通路有關；亞網絡B 由19 個節點和45 個相互作用關系組成（見圖 4B），其主要與細胞粘附分子（CAMs）、PI3K-Akt 信號通路、氨基酸代謝信號通路相關。

圖4. DEGs 的PPI 網絡分析（在Orange 中36 個上調基因呈紅色，78 個下調基因呈藍色）；（A）亞網絡A 由19 個節點和50 個相互作用關系組成；（B）亞網絡B 由19 個節點和45 個相互作用關系組成

3 討論

近年來，鼻咽癌的診斷和治療都取得了長足的進步。血漿EBV DNA 已被證明是鼻咽癌篩查、診斷、監測和治療中重要的生物標志物?；谏锎髷祿治觥⒑Y選及確定相關信號通路的研究已經逐步在科研領域開展。本次研究中利用NCBI-GEO 數據平臺，提取4 個基因芯片數據集，篩選DEGs 并富集分析DEGs 功能，發現36 個節點基因（FN1、CD19、C3、CXCL10、CLU、PROM1、CD22、MMP3、CR2、SCGB1A1、MEF2C、PAX5、PIGR、GAD1、PLAU、MAD2L1、MSLN、VCAN、DST、HOXA10、LTF、MS4A1、MUC16、PTGDS、ANG、SPAG6、TC L1A、TEKT2、TSPAN8、ATP12A、BANK1、CR1、DNAI1、KLF2、KRT7、NRXN1），這些節點基因均與鼻咽癌的發生發展密切相關。

前簇蛋白（clusterin，CLU）是一種廣泛分布在細胞之間的蛋白質，可參與許多生物學過程，例如組織分化、細胞粘附、細胞間或細胞與基質之間的相互作用等。最近人們發現，CLU 涉及許多病理狀態（如神經變性和癌癥）的發生發展。CLU 在多種癌癥組織中的表達上調[11,12]。CLU的表達由癌基因和癌蛋白共同調節，與轉移表型相關，其作用機理是調節MMP-2、MMP-9、VEGF 和E- 鈣粘蛋白的表達[13,14]。鼻咽癌是具有高轉移性臨床病理特征的腫瘤。有研究表明，CLU 與鼻咽癌的轉移密切相關。實驗發現，DNP 可增加CLU、 基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9 和血管內皮生長因子（VEGF）的表達，DNP 通過上調CLU 可進一步增加MMP-9 和VEGF 的表達。同時DNP 也增加CLU 與MMP-9 或VEGF的結合，CLU、MMP-9 和VEGF 與腫瘤淋巴結轉移（TNM）分類呈正相關。這些結果表明，DNP 可能通過上調CLU，MMP-9 和VEGF 的表達來促進鼻咽癌腫瘤組織的轉移。因此，升高的CLU 表達可能是鼻咽癌高轉移的重要因素，而CLU 可以作為鼻咽癌轉移的生物標志物[15]。

MMP3 與腫瘤細胞的轉移相關，單獨發生MMP3 的異位表達足以增加細胞的運動性。MMP3 可以通過幾種方式促進細胞的遷移，例如，MMP3 可以裂解E- 鈣粘著蛋白，促進細胞解離，增加細胞的運動性，觸發上皮細胞向間充質細胞轉化，并可能誘導角質形成細胞生長因子的產生[16]。角質形成細胞生長因子是一種與細胞遷移增強有關的分泌蛋白[17]。Zta 是Epstein-Barr 病毒（EBV）的裂解性反式激活因子，目前已被證明可促進上皮細胞的遷移和侵襲[18]。Zta 因子可直接靶向MMP3 和MMP9 的啟動子，還可誘導MMP3 與MMP9 的表達。Zta 誘導細胞遷移的過程需要MMP3，但不需要MMP9。體外實驗表明，MMP3 和MMP9都有助于Zta 誘導細胞侵襲。Zta 的表達與鼻咽癌的頸部轉移相關[19]。亞網絡A 中的PAX5 目前已被證明是EBV 依賴的細胞增殖的主要參與者，并且先前被鑒定為裂解性EBV活化的抑制劑[20]，與病毒侵入及增殖密切相關。

亞網絡B 中的FN1 基因是ECM 糖蛋白家族的成員，在細胞粘附、遷移極性和組織重塑中可起到關鍵的作用。FN1也有利于維持微血管的完整性和抗感染性[21]。此外，最近已證實FN1 與各種癌癥中的細胞轉移、分化和粘附密切相關，并且FN1 的下調會抑制癌細胞的侵襲和轉移。FN1 的下調可以抑制食管癌細胞的侵襲、轉移和增殖。有人指出，減毒的FN1 可以有效抑制胃癌細胞的轉移[22-23]。相關的研究表明，通過抑制FN1 來使AKT 信號通路失活[24]，可減少鼻咽癌病灶中發生的腫瘤浸潤、轉移和血管生成。AKT信號通路在調節正常細胞和癌細胞的存活、增殖、凋亡和營養代謝等過程中均能起到至關重要的作用[25]。先前的研究表明，AKT 信號通路在鼻咽癌的惡化過程中起著關鍵的作用，而AKT 信號通路的下調可抑制鼻咽癌細胞的發育，抑制AKT 信號通路的激活則可抑制鼻咽癌細胞的侵襲和轉移[26]。此外，FN1 的過表達還與潛伏膜蛋白1 的表達有關，對鼻咽癌患者具有獨立的預后評估價值[27]。

本研究的結果證實，應用組學技術可以揭示腫瘤發生的復雜分子事件及控制重要的腫瘤行為，如腫瘤的侵襲、轉移和對治療耐受等。鼻咽癌的發生與多種因素密切相關，相關因素包括病毒侵襲、基因表達異常、細胞增殖及信號通路激活。從多基因水平探討鼻咽癌的可能發病機制，可以為鼻咽癌的早期診斷、治療研究提供潛在的科研線索。