糞大腸菌群測定的多管發酵法與紙片快速法比對分析

王 潔，廖 芬，田俊良

(六盤水生態環境監測中心 貴州 六盤水 553000)

1 引言

糞大腸菌群是總大腸菌群中的一部分，主要來自糞便，在44.5 ℃溫度下能生長并發酵乳糖產酸產氣[1]。六盤水生態環境監測中心一直采用多管發酵法進行水質中糞大腸菌群的測定，此方法精度高，但操做時間長，步驟較為繁瑣，需驗證實驗[2]，如果發酵管中存在其他種類的產氣菌，會致使檢測結果偏離[3]。本次實驗是對多管發酵法與紙片快速法進行實驗比對，對相同的實驗樣品分別用此兩種方法進行檢測和結果評價，比較兩種方法的有效性和可比性。

2 實驗概況

2.1 材料與方法

多管發酵法：乳糖蛋白培養基、EC肉湯培養基。

紙片快速法：BD105 I水質(糞)大腸菌群快速檢驗紙片、BD105Ⅱ水質(糞)大腸菌群快速檢驗紙片。

2.2 儀器和設備

隔水式電熱恒溫培養箱(檢定溫度37 ℃)、電熱恒溫培養箱(檢定溫度44.5 ℃)[4]、立式壓力蒸汽滅菌器

2.3 實驗步驟

2.3.1 多管發酵法

(1)水樣接種。嚴格按照國標要求，將水樣充分混勻后根據試樣濃度確定接種量。每個樣品用3個不同的水樣量接種，同一水樣量接種5管。

(2)初發酵實驗。將水樣分別接種到盛有乳糖蛋白培養液的發酵管中，在37 ℃±0.5 ℃下培養24 h，產酸和產氣的發酵管表明實驗陽性。如在試管內產氣不明顯，則輕拍試管，有小氣泡升起為陽性。

(3)復發酵實驗。輕微震蕩初發酵實驗陽性結果的發酵管，用3 mm接種環將培養物轉接到EC培養液中。在44.5 ℃±0.5 ℃溫度下培養24 h。培養后立即進行結果判定[5]。

2.3.2 紙片快速法

每個樣品按3個10倍遞減的不同接種量接種，每個接種量分別接種5張紙片，共接種15張紙片。根據水樣污染程度確定接種量，盡可能使5個接種量最大的紙片為陽性、5個接種量最小的紙片為陰性，避免出現所有3個不同接種量共15張紙片全部為陽性或全部為陰性。接種后的試樣在44.5 ℃±0.5 ℃溫度下培養24 h后觀察，進行結果判讀[6]。

2.3.3 對照實驗

(1)空白對照。每一批次樣品均做一空白對照實驗，用無菌水做全程序空白測定，兩種實驗方法培養后均不得有任何顏色反應，否則該次樣品測定結果無效[7,8]。

(2)陽性及陰性對照。糞大腸菌群測定的陽性菌株為大腸埃希氏菌，陰性菌株為產氣腸桿菌。上述標準菌株均制成濃度為300～3000個/mL的菌懸液，分別取相應水量的菌懸液接種，陽性與陰性菌株各5份，與測試樣品一起培養。大腸埃希氏菌應全部呈現陽性反應，產氣腸桿菌應全部呈現陰性反應，否則，該次樣品測定結果無效，應查明原因后重新測定[9]。

3 結果與分析

兩種方法比對實驗測定結果見表1。

糞大腸菌群檢測結果與平行雙樣測定結果對照試樣中的最可能數和95%置信限值進行比對結果判定，若同一試樣檢測結果均在兩種檢測方法的95%置信限值內，則比對成功，判定比對結果合格。實驗結果判定詳見表2，平行雙樣結果判定詳見表3。

由空白及陰陽對照實驗可知:陰性對照結果全陰性，證明實驗環境、培養基、操作過程未受到污染，排除假陽性干擾；陽性對照結果全陽性，證明培養基、培養條件、檢測方法合適，能有效培養出目標菌群；空白對照全部未檢出，排除實驗用水的干擾。對照實驗結果表明此次比對測試結果可信，具有參考價值[10]。

由數據可知，多管發酵法多個樣品存在測值略高于紙片快速法的情況，究其原因可能是測試樣品中存在其他種類的產氣菌，多管發酵法以產氣判定陽性，所以部分測試樣品值略高于紙片快速法。

表1 實驗測定結果統計

表2 糞大腸菌群實驗結果判定

表3 糞大腸菌群平行雙樣實驗結果判定

4 結論

在兩種測試實驗中均設置陽性菌株對照和陰性菌株對照，每一批次樣品均做一空白樣品對照，對實驗全過程進行質量控制。通過在細菌室對12個受不同污染程度的水樣進行方法比對實驗，結果表明：由輕度至重污染的水樣比對結果均合格，糞大腸菌群的測定由此兩種方法測定均適用。相比多管發酵法紙片快速法測定省去培養基配置與滅菌、接種復發酵環節，操作簡便，且培養時限比多管發酵法縮短24 h，更加方便快捷安全，更適用于水質中糞大腸菌群的快速測定。