脂肪基質血管組分對膝骨關節炎模型大鼠疼痛及軟骨修復的研究

楊錦熒 樓袁美 葛彥志 陳祖祥 單樂天 陸海山 賈明

膝骨關節炎（KOA）是以膝內側疼痛、行走活動時膝痛加重、活動受限、關節畸形等為主要表現，并伴有軟骨損傷、骨贅形成等臨床癥狀的常見骨科疾病［1］。流行病學顯示，55歲以上人群中約60%有KOA表現，65歲以上老年人KOA的發病率可達85%［2］。脂肪基質血管組分（SVF）是從脂肪組織中去除成熟脂肪細胞后剩余的水相組分，含有多種具有修復功能的細胞以及細胞因子，包括脂肪源性干細胞（ADSCs）、內皮祖細胞、內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞、淋巴細胞、周細胞、造血干細胞和脂肪前體細胞等［3］。其中，ADSCs是SVF的重要組成部分，具有多向分化潛能，有較強的血管再生能力、免疫調節能力、抗炎能力、成骨和軟骨形成能力［4-5］，具有較高的臨床應用價值。已有研究證明活體關節腔內注射SVF輔助治療KOA，能促進軟骨增生，起到修復和治療KOA的作用［6］。本研究通過觀察不同濃度的SVF干預KOA大鼠疼痛模型，探討其對KOA關節疼痛和軟骨退變的治療效果，為臨床SVF的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級SD大鼠25只，體質量（200±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物合格證號：SCKK（滬）2007-0005，于浙江中醫藥大學動物實驗中心進行實驗。實驗方案通過醫學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 試劑及儀器 胎牛血清（FBS）、磷酸緩沖溶液（PBS）、Ⅱ型膠原酶、生理鹽水、碘乙酸（美國Sigma公司）、手術剪刀、注射針、戊巴比妥鈉、10%水合氯醛、4%多聚甲醛溶液、EDTA脫鈣液（中國Solarbio公司）、YLS-3E電子壓痛儀（安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司）。

1.3 實驗方法 （1）SVF制備及質量控制：利用膠原酶消化法制備SVF［7］。將5只SD大鼠處死后，無菌條件下取雙側腹股溝脂肪組織，PBS清洗3次，去除肉眼可見的筋膜后剪碎，加5倍體積0.2%的Ⅱ型膠原酶于37 ℃恒溫箱內磁力攪拌50～60 min，適量10% FBS終止消化，離心，棄上清液，PBS清洗，重復3次。最后離心所得沉淀物即為SVF，用PBS配成低（1.6×104個 /mL）、中（3.2×104個 /mL）、高（6.4×104個/mL）三個濃度，低溫保存備用。（2）大鼠分組、造模及干預：將25只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、SVF低濃度組、SVF中濃度組、SVF高濃度組，每組各5只。模型組、SVF低濃度組、SVF中濃度組和SVF高濃度組大鼠的雙側膝關節腔內各注射20 mg/ml碘乙酸50 μl復制KOA模型，正常組大鼠注射等量生理鹽水。1周后分別向SVF低、中、高濃度組大鼠雙側后肢膝關節腔各注射50 μl低、中、高濃度SVF，正常組和模型組大鼠雙側膝關節腔注射等量生理鹽水，1次/周，連續4次。（3）壓痛閾值測定：使用YLS-3E電子壓痛儀檢測大鼠的壓痛閾值。將大鼠放置于固鼠籠中，用扁型頭對大鼠雙側后足背近節趾骨底連線進行施壓，當大鼠因壓痛而出現嘶叫或掙扎時顯示的壓力值為大鼠的壓痛閾值。實驗開始前先測定基礎閾值，再分別于模型復制后第2、4周檢測痛閾。（4）膝關節軟骨組織病理學觀察：最后1次痛閾測試結束后，10%水合氯醛麻醉處死大鼠并取5組大鼠雙側膝關節于4%多聚甲醛固定48 h，用EDTA脫鈣8周，酒精逐級脫水，石蠟包埋后用切片機將脛骨外側和股骨外側髁軟骨下骨松質沿下肢縱軸方向切片，切片厚度為5 μm。切片樣本進行常規脫蠟復水，經清水沖洗后進行HE染色和SO染色、封片。光鏡下觀察組織的病理學改變，并按照OARSI軟骨組織學評分標準［8］進行評分。

1.4 統計學方法 采用DPS 9.5更新版統計軟件。以（）表示。5組大鼠的痛閾值檢測和OARSI評分均使用單因素方差分析，再采用LSD比較。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 五組壓痛閾值檢測結果比較 模型復制后第2周，模型組和SVF低、中、高濃度組的壓痛閾值相較于正常組均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）；模型組和SVF低、中、高濃度組之間壓痛閾值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。模型復制后第4周，模型組的壓痛閾值低于正常組，差異有統計學意義（P＜0.01）；SVF低、中、高濃度組的壓痛閾值與模型組比較均顯著提高，差異均有統計學意義（P＜0.01）；SVF高濃度組的壓痛閾值高于SVF低濃度組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 1。

圖1 各組壓痛閾值檢測結果比較

2.2 五組大鼠膝關節軟骨組織SO染色病理結果比較 與正常組比較，模型組大鼠膝關節軟骨表層纖維化明顯，軟骨層明顯變薄，軟骨細胞重度肥大且嚴重丟失，軟骨下骨呈現纖維化退變。低、中、高濃度的SVF對KOA模型大鼠關節軟骨均有改善作用，其中SVF低濃度組軟骨表面部分缺損，軟骨層輕度變薄，少量軟骨細胞輕度肥大，軟骨下骨輕度纖維化退變；SVF中濃度組軟骨表層纖維化，軟骨層變薄，軟骨細胞部分丟失，輕度軟骨細胞肥大；SVF高濃度組軟骨表層纖維化，軟骨層變薄，軟骨細胞部分丟失，軟骨細胞中度肥大。見圖2。

圖2 各組大鼠膝關節軟骨組織SO染色病理結果

2.3 五組大鼠膝關節軟骨組織HE染色病理結果比較 與正常組比較，模型組大鼠膝關節軟骨表面缺損明顯，缺損處軟骨細胞丟失嚴重，有大量重度肥大的軟骨細胞，軟骨下骨呈現纖維化退變。SVF低、中、高濃度組大鼠膝關節軟骨與模型組比較，軟骨形態明顯改善。SVF低濃度組可見軟骨表面輕度缺失，軟骨細胞部分丟失，可見軟骨細胞輕度肥大，軟骨下骨部分纖維化；SVF中濃度組可見軟骨表面平整，部分軟骨細胞丟失，少量軟骨細胞輕度肥大，軟骨下骨纖維化；SVF高濃度組可見軟骨表面平整，大量軟骨細胞存活，少量軟骨細胞肥大，部分軟骨下骨纖維化。見圖3。

2.4 五組大鼠膝關節軟骨OARSI評分比較 模型組OARSI評分明顯高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.01）；SVF低、中、高濃度組的OARSI評分與模型組相較均顯著下降，差異均有統計學意義（P＜0.01），但SVF低、中、高濃度組之間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖 3。

圖3 五組大鼠膝關節軟骨組織HE染色病理結果和OARSI評分

3 討論

KOA起病于關節軟骨，關節軟骨缺乏血管和神經的支配，再生和自我修復能力有限，損傷后難以自我修復，繼而逐漸侵蝕至軟骨下骨及周圍組織，從而引發膝關節部位疼痛不適、活動障礙和畸形［9-10］。SVF來源于脂肪組織，含有多種具有修復功能的細胞以及細胞因子，其中的主要成分ADSCs可分化為軟骨細胞，促進軟骨修復，有效抑制骨關節炎進展［11-12］，此外，SVF中所含的細胞外基質具有支持營養作用，可加快組織重塑［13-14］。與ADSCs相較，SVF同樣具有分化軟骨細胞及成骨細胞的能力，且所含成分更多，擁有更強的治療能力，去除脂肪組織中的成熟脂肪細胞即制備得到，在手術室便可完成，不需體外擴增，節省體外擴增時間，并避免了體外培養帶來的污染等問題［15］，因此SVF相較于ADSCs在治療KOA方面有著一定優勢。

碘乙酸主要是通過破壞關節軟骨和周圍滑膜韌帶，改變關節腔原有的穩態［16］，引起軟骨基質的退行性改變、軟骨細胞的破壞凋亡、滑膜炎性改變等造成KOA 模型［17］。POMONIS等［18］用碘乙酸復制 KOA 動物模型，認為碘乙酸與KOA疼痛相關，碘乙酸誘發的大鼠KOA具有較好的均一性和可比性。研究發現，ADSCs關節腔注射給藥每周一次，持續4周，能修復受損的關節軟骨，恢復關節功能［19］。每周關節腔注射給藥一次，持續4周能達到較好的治療效果，故作為關節腔給藥的常用頻次。

本研究疼痛閾值檢測結果表明，SVF可促進關節軟骨的修復，并有效提高KOA疼痛閾值，低濃度的SVF就可以達到良好的效果，且治療效果與治療濃度呈一定程度的正相關。關節組織病理結果表明，關節腔注射SVF具有減輕關節疼痛，促進關節軟骨增殖修復等作用。實驗中沒有明顯不良反應的發生，證明了SVF治療的有效性和安全性。本研究主要不足之處為尚處于動物實驗階段，對SVF緩解疼痛、促進軟骨細胞再生和（或）軟骨祖細胞原位再生、受損關節軟骨修復過程和具體機制尚不清楚。KOA的發生發展受多種因素影響，SVF不僅能夠預防、治療KOA，還可以阻止受損關節的進一步發展，甚至逆轉KOA的發病機制，使之恢復正常，仍需要大量的基礎實驗和臨床探索研究驗證。

綜上，SVF能有效緩解KOA疼痛，促進關節修復，低劑量就能有明顯效果，具有獲取方便、低劑量、安全、有效等優點，有進一步深入研究的潛在價值。