基于瘀毒互結病機理論探討隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌的作用機制

杜仲燕 魯軍 趙正奇 張光霽

胃癌（Gastric cancer，GC）是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤。《2020年全球癌癥統計報告》［1］顯示，全球范圍內胃癌的發病率（5.6%）居第5位，死亡率（7.7%）排第4位。近年來，隨著診斷前移與治療方式的多樣化，早期胃癌患者的生存率有所提高，但晚期胃癌患者的預后仍然較差，中位生存期約為1年［2-4］。目前，中醫中藥在腫瘤進展、腫瘤耐藥、改善癥狀等方面的獨特優勢，得到廣泛關注。深入挖掘中醫中藥在胃癌治療中的潛在靶點，闡明胃癌治療的分子作用機制，已然成為研究的重點。基于大量的理論、實驗和臨床研究，張光霽教授創新性提出“久病必瘀、因瘀致毒、因毒致變、瘀毒互結”是中醫腫瘤的核心病機之一，化瘀攻毒、瘀毒同治是中醫腫瘤的主要治法［5］。本研究基于瘀毒互結病機理論，通過網絡藥理學工具探討隱丹參酮聯合三氧化二砷治療胃癌的潛在靶點和分子作用機制，以期為新藥研發和腫瘤臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 網絡藥理學相關工具 TCMSP數據庫［6］（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）獲取隱丹參酮相關靶點，Drugbank數據庫（https：//go.drugbank.com/）獲取三氧化二砷相關靶點，GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org）、DisGeNet數據庫（http：//www.disgenet.org）、OMIM 數據庫（（http：//www.omim.org）獲取胃癌相關靶點，Draw Venn Diagrams（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）獲取隱丹參酮合用三氧化二砷治療胃癌的作用靶點，STRING數據庫（https：//string-db.org/）進行PPI分析，Cytoscape3.7.0軟件構建藥物和疾病相互作用網絡，R clusterProfiler進行GO和KEGG富集分析，Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）進行靶點校準。以上工具的使用時間截止至2021年5月。隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌的研究路線圖，見圖1。

圖1 隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌的研究路線圖

1.2 研究方法 （1）隱丹參酮與三氧化二砷靶點的獲取：以Cryptotanshinone為檢索詞，通過TCMSP工具，檢索隱丹參酮的相關靶點，并通過Uniprot工具進行校準；以Arsenic Trioxide為檢索詞，通過Drugbank工具，檢索到三氧化二砷的相關靶點，并匯總靶點的Gene Name和Uniprot ID。（2）胃癌靶點的獲取：以“Gastric Cancer”為檢索詞，通過GeneCards、DisGeNet和OMIM工具，檢索胃癌的相關靶點，通過Draw Venn Diagrams工具去重后得到胃癌相關靶點的合集。（3）藥物-疾病網絡的構建及分析：通過Draw Venn Diagrams工具，獲取隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌的作用靶點，并通過Cytoscape工具，構建藥物-靶點-疾病網絡。（4）蛋白互作網絡（PPI）的構建：通過STRING工具，把隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌的相關作用靶點上傳至工具，獲取PPI網絡。（5）GO與KEGG富集分析：通過R clusterProfiler，分析隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌的相關作用靶點的GO功能注釋與KEGG信號通路富集。

2 結果

2.1 隱丹參酮與三氧化二砷的靶點 獲取隱丹參酮的相關靶點共30個，獲取三氧化二砷靶點10個，去重后共有39個潛在作用靶點。

2.2 胃癌靶點 通過GeneCards、DisGeNet和OMIM工具檢索，分別獲取胃癌靶點12153個、34個、505個，去重后共為12511個，見圖2A。隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌映射得到38個共同靶點，見圖2B。

圖2 胃癌靶點與隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌的對應靶點

2.3 網絡構建及分析 通過Cytoscape工具構建隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌的相互作用關系的可視化網絡，發現不同的藥物可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，充分體現了隱丹參酮聯用三氧化二砷多靶點的作用機制。見圖3。

圖3 隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌的藥物-靶點-疾病網絡關系圖

2.4 PPI網絡的構建 為了更好地理解隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌的作用機制，基于PPI關系并使用STRING工具構建隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌相關靶點的PPI網絡，見圖4。PPI網絡包含38個蛋白質節點，196條相互作用關系（連線），其中SCN5A與其他蛋白質節點無相互作用關系。通過R語言計算靶點的degree，并繪制barplot圖，顯示MAPK3、AKT1、APP、JUN、STAT3、EDN1、TNF、CCND1、MAPK1、RELA為排名前十的核心靶點，見圖5。

圖4 隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌相關靶點的PPI網絡

圖5 隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌排名前十的核心靶點

2.5 藥物-疾病靶點GO分析 根據隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌相關的靶點進行GO分析，得到靶點具有的功能信息62條（P＜0.05），按P值選取前20條，見圖6。結果發現，其功能涉及泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、抑制轉錄因子結合、G蛋白偶聯的胺受體活性、突觸后神經遞質受體活性、乙酰膽堿受體活性、血清素受體活性、RNA聚合酶II特異的DNA結合轉錄因子結合等。

圖6 隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌靶點的GO分析

2.6 藥物-疾病靶點KEGG分析 以P＜0.05進行篩選，得到139條信號通路，按P值選取前20條，并按通路富集靶點個數排序。其中，前20條KEGG通路為TNF信號通路、細胞凋亡、神經活性配體-受體相互作用、cAMP信號通路、鈣信號通路、糖尿病并發癥中的AGERAGE信號通路、膽堿能突觸、癌癥中PD-L1表達和PD-1檢查點途徑等，表明隱丹參酮聯用三氧化二砷的有效成分可能通過作用以上通路來治療胃癌。其中，核心靶點RelA在TNF信號通路、細胞凋亡、cAMP信號通路等16條信號通路中均有涉及。見圖7和表1。

表1 隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌潛在靶點的KEGG通路分析

圖7 隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌靶點的KEGG分析

3 討論

胃癌在全球范圍內的發病率與死亡率居高不下，晚期胃癌患者的預后較差、生存期較短，嚴重威脅人類的生命健康［7］。近年來，中醫中藥治療胃癌的優勢逐漸凸顯，是腫瘤精準化醫療發展、多靶點藥物發現的源泉，而且蘊藏著巨大的新藥創制資源［8］。中醫學雖無“胃癌”之病名，但可歸于“胃脘痛”“癥瘕”“積聚”“痞證”“脾積”等范疇。《諸病源候論》［9］曰：“血瘀于內，時時體熱面黃，瘀久不消，則變成積聚癥瘕也”，《仁齋直指方論》［10］曰：“癌者上高下深，巖穴之狀……毒根深藏，穿孔透里”。瘀為毒之基，毒為瘀之甚，瘀可蘊毒、毒復致瘀，最終導致瘀毒互結。張光霽教授認為胃癌病因病機復雜，往往交雜互結為患，核心病機為瘀毒互結，治宜化瘀攻毒、瘀毒同治。

丹參始載于《神農本草經》，具有活血化瘀、通經止痛等功效，多用于治療癥瘕積聚、脘腹脅痛等疾病［11］。隱丹參酮由丹參的干燥根和根莖中提取而來，是丹參有效成分之一，是一種具有多種藥理作用的天然喹諾酮二萜［12］。砒霜是以毒攻毒治癌中藥的代表藥，三氧化二砷是其主要活性成分。研究證實，隱丹參酮和三氧化二砷可用于胃癌等多種惡性腫瘤的治療［13-15］，但具體作用機制不明。本研究旨在探討隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌的具體分子作用機制，基于網絡藥理學理論采用TCMSP、Drugbank、GeneCards等工具篩選出隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌的潛在靶點共38個，分別為 MAPK3、AKT1、APP、JUN、STAT3、EDN1、TNF、CCND1、MAPK1、RELA等，涉及G蛋白偶聯的胺受體活性、乙酰膽堿受體活性、G蛋白偶聯的血清素受體活性、血清素受體活性、泛素蛋白連接酶結合、肽結合、泛素樣蛋白連接酶結合、抑制轉錄因子結合等GO富集分析，涉及cAMP信號通路、TNF信號通路、細胞凋亡、神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、癌癥中PD-L1表達和PD-1檢查點途徑等炎癥、代謝、免疫方面。

通過STRING和R語言工具篩選得到蛋白互作網絡排名前十的核心靶點，RelA為其中之一。RelA雖為隱丹參酮的預測靶點，但通過隱丹參酮與三氧化二砷的聯用，與16個靶點相互作用，并在排名前20的GO分析中參與了泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合等6個GO過程，在排名前20的KEGG通路中參與了TNF信號通路、細胞凋亡等16條信號通路。RelA為核轉錄因子 -κB/p65（Nuclear Factor-kappa B/p65，NF-κB/p65），是最重要的功能亞基［16］，在人體胃癌組織中RelA核易位顯著增高，NF-κB被激活。NF-κB是免疫應答與炎癥反應中的一種重要調控蛋白，NF-κB的不適當激活與胃癌的發生、發展、浸潤轉移和化療敏感性密切相關［17］。泛素化作用可影響蛋白質的穩定性和功能，從而調節廣泛的細胞過程，泛素化機制的失調會導致胃癌等多種惡性腫瘤，RelA多個賴氨酸殘基存在泛素化修飾，在腫瘤壞死因子受體相關因子7作用下促進泛素化，并進行溶酶體內降解，從而抑制NF-κB活性［18］，而隱丹參酮和三氧化二砷均可抑制NF-κB活化［19-20］。由此推測，隱丹參酮聯用三氧化二砷治療胃癌可能是通過靶向RelA，并促其泛素化，從而抑制NF-κB活化來實現的。

NF-κB抑制劑在臨床上被廣泛應用于胃癌的治療，但由于NF-κB信號通路在機體內的交互性和復雜性，廣泛抑制其活性會帶來較多的不良反應，導致NF-κB抑制劑的臨床療效并不理想，這也促使著科研工作者去尋找更精準的NF-κB抑制劑。隱丹參酮聯用三氧化二砷有可能成為精準治療胃癌的新型藥物，考慮到網路藥理學工具的預測特殊性，本研究將在后續實驗驗證中夯實預測，為中醫病機理論的臨床應用實踐提供科學的依據與參考。