長鏈非編碼RNA LINC00460在非小細胞肺癌中的表達及作用機制

丁夢杰 張旭東 胡俊霞

作為臨床實踐中最常見的惡性腫瘤，85%的肺癌為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[1]。 非小細胞肺癌患者主要類型為腺癌，大細胞癌及鱗狀細胞癌[2]。 由于非小細胞肺癌患者的臨床癥狀體征不明顯，大多數患者初次入院確診時處于晚期治療階段?，F階段，隨著醫學衛生事業的進步與完善，肺癌分子生物學也在不停的發展，新藥不斷被研制應用，然而晚期非小細胞肺癌患者的5年生存率仍然只有15%[3-5]。 故積極尋找治療非小細胞肺癌患者的新方法，探索有用的治療靶點，是目前國內外臨床研究的熱門話題。相關研究[6-7]指出，長鏈非編碼RNAs的異常表達可能與人類疾病關聯，在腫瘤出現、增殖、侵入、遷移、耐藥和復發等過程中起著重要調節作用，可能成為癌癥治療的新靶點。目前，已經闡明了一些LncRNA在腫瘤發生機制中的作用，例如位于HOXC 12q13.13的HOTAIR對乳腺癌有重要影響[8]。 相較而言，關于lncRNA在人類肺癌分子生物學機制中的研究很少。本文檢測了lncRNA LINC00460在NSCLC患者癌組織與癌旁組織中的表達情況，旨在分析lncRNA LINC00460與患者臨床因素的關系及長鏈非編碼RNA LINC00460在非小細胞肺癌預后中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

使用回顧性調查法，選取2018年3月至2019年在我院收治的90例非小細胞肺癌患者作為研究對象，根據lncRNA LINC00460在癌細胞組織中的表達水平，將高表達水平患者(≥8.45)設為觀察組(56例)，低表達水平患者(<8.45)設為對照組(34例)。觀察組男性39例，女性為17例，年齡為34～80歲，平均年齡為(57.48±8.72)歲。對照組男性21例，女性13例，年齡為32～81歲，平均年齡為(56.14±9.33)歲。2組患者均同意并接受手術治療。2組患者的臨床資料存在可比性(P>0.05)。本研究征得我院倫理委員會的批準同意。

1.2 納入與排除標準

納入標準[9]：①所有患者經手術治療，病理結果確診為原發性非小細胞肺癌；②術前未接受放化療及其他輔助治療；③患者無精神障礙，依從性良好，能夠配合。

排除標準[10]：①心肝腎等器官功能障礙，存在血液性疾病，急性感染，藥物過敏史；②合并其他惡性腫瘤；③臨床資料不全或中途退出者。

1.3 實驗與方法

1.3.1 試劑與儀器 由南京諾唯贊生物工程有限公合成lncRNA LINC00460引物；使用購自ABI公司的逆轉錄試劑盒與RNA提取試劑盒；使用購自TaKaRa公司STBR Premix Ex Taq試劑盒；使用購自ABI公司；紫外分光光度計購自賽默飛公司實時動態定量聚合酶鏈反應(qPCR)儀。

1.3.2 研究方法 (1)總RNA提?。和ㄟ^超聲處理使50 mg樣品組織均質化，根據RNA提取試劑盒的說明從組織中提取總RNA。(2)逆轉錄反應：1 μmol/l逆轉錄特異性引物3 μl，10×RT緩沖液1.5 μl 100 mmol/l dNTP0.1 5 μl，50 U/μl MultiScribeTM逆轉錄酶1.0 μl，20 U/μl RNase抑制劑0.19 μl，總RNA 1 μl，用DEPC水補至20 μl。 作用條件：在25 ℃反應10 min，在37 ℃反應60 min，在85 ℃反應5 min，在4 ℃下儲存使用。(3)qPCR擴增：嚴格按照STBR Premix Ex Taq試劑盒操作說明書進行操作。 5'-ACAGCATGAGCCAGGA-CATC-3'為lncRNA LINC00460上游引物，5'-GAAAGCTGCAACAT-GCTCCC-3'為下游引物。 將以下試劑加入冰中：1 μl逆轉錄產物cDNA，1 μl引物，10 μl TaqManGEx MASTER Mix和20 μl雙蒸水。 作用條件：在95 ℃下預變性5 min，95 ℃15 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，總共40個循環。(4)數據處理：以GAPDH為內參，2-ΔΔCt值(lncRNA LINC00460)-2-ΔΔCt值(GAPDH)為lncRNA LINC00460相對表達水平。

1.4 統計學方法

本組研究數據經整合后均采用 SPSS20.0 版進行處理分析，計數資料數據用百分比(%)表示，用卡方或 Fisher 確切概率法進行檢驗；計量資料數據用表示，組間比較用t檢驗，使用Cox多元素回歸模型分析 lncRNA 與非小細胞肺癌患者臨床預后的關系，數據對比差異顯著且存在統計學意義用P<0.05 表示。

2 結果

2.1 lncRNA LINC00460在非小細胞肺癌患者癌旁組織與癌組織中的表達水平

RT-qPCR檢測結果顯示，90例非小細胞肺癌患者中癌旁組織lncRNA LINC00460 的相對表達均值為(1.58±0.86)，低于癌組織的(8.54±3.05)，差異有統計學意義(t=20.836，P<0.05)。

2.2 非小細胞肺癌患者臨床病理特征與lncRNA LINC00460表達的關系

2組患者的癌組織中lncRNA LINC00460表達水平在性別、年齡、病理分型、腫瘤直徑及血管侵犯方面進行對比，差異無統計學意義(P>0.05)；但2組患者的癌組織中lncRNA LINC00460表達水平在分化程度與有無發生淋巴結轉移方面的差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 非小細胞肺癌患者臨床病理特征與lncRNA LINC00460表達的關系/例

2.3 lncRNA LINC00460的表達與非小細胞肺癌患者預后的關系

觀察組56例患者lncRNA LINC00460平均表達水平為(5.63±1.96)；對照組34例患者lncRNA LINC00460平均表達水平為(10.17±3.14)。觀察組與對照組的無進展生存率分別為(9.4±1.2)月與(18.9±2.1)月，2組對比差異存在統計學意義(P<0.05)。觀察組與對照組的總生存期分別為(14.7±2.1)月和(22.7±1.6)月，2組對比差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 LINC00460的表達與非小細胞肺癌患者預后的關系月)

2.4 非小細胞肺癌患者總生存期cox 回歸分析

單因素COX分析顯示，男性、腫瘤直徑、血管侵犯、淋巴結轉移、LINC00460高表達是非小細胞肺癌患者總生存期的危險因素。多因素 COX 回歸模型顯示lncRNA LINC00460 高表達水平患者與非小細胞肺癌患者的總生存期(HR = 2.31，95% CI：1.76 ～3.69，P= 0.013)相關，是其獨立預后影響因子，男性、腫瘤直徑、血管侵犯及淋巴結轉移是非小細胞肺癌患者總生存期的獨立危險因素，見表3。

表3 非小細胞肺癌患者總生存期cox 回歸分析

3 討論

近年來，肺癌的發病率與死亡率居高不下，由于缺少高效的初始生物標志物，早期臨床檢測率低，患者出現身體不適就診時處于晚期階段[11]。多數研究人員著手研究非小細胞肺癌患者的發病機制，但其機制尚未完全了解，治療效果不佳。 已有資料[12]報道，lncRNA在各種腫瘤的病理生理過程中發揮重要作用。目前，探索非小細胞肺癌患者的發病機制和治療方式已成為研究的熱點[13-14]。RNA測序及lncRNAs微陣列等技術的發展和使用讓更多的非小細胞肺癌患者失調的lncRNA被發現[15-17]。以癌基因或腫瘤抑制基因參與癌癥進展，lncRNAs是非小細胞肺癌患者診斷和臨床預后的治療靶點及重要生物標志物[18-19]。

作為非編碼RNA，lncRNA不僅影響蛋白質，還可以影響細胞自身的各種過程，例如細胞分化、細胞生長，劑量校正、DNA損傷與染色體印跡。MR-NA和miRNA結合形成復合物，導致lncRNA的二級和三級結構，其調節基因轉錄，蛋白質翻譯過程和mRNA穩定結構，現階段，尚未有精確的機制[20-23]。lncRNA LINC01296介入肺癌的發展可能與特定信號轉導通路中重要蛋白的轉錄或修飾相關。相關研究[24]指出，lncRNA LINC01296可能與PI3K-Akt-mTOR通路存在關聯，這是癌癥有關的主通路之一，在癌癥進展中發揮重大作用。在本研究的早期階段，lncRNALINC00460在非小細胞肺癌癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，本文RT-qPCR結果顯示非小細胞肺癌患者癌組織中lncRNA LINC00460的表達量高于癌旁組織(P<0.05)，與之前報道的基因芯片的結果相一致[25]。此外，本研究追蹤了觀察組和對照組患者無進展生存期及總生存期，結果顯示觀察組和對照組患者無進展生存期分別為(9.4±1.2)月和(18.9±2.1)月，總生存期分別為(14.7±2.1)月和(22.7±1.6)月，差異均有統計學意義(P<0.05)。表明了lncRNALINC00460表達上調可能和患者預后不良關聯。 lncRNALINC00460表達下調一定程度上可改善患者臨床預后并延長生存期。

本研究對lncRNA LINC00460表達與非小細胞肺癌患者組織中患者病理學特征進行分析，發現，不同性別、年齡、病理分型、腫瘤直徑及血管侵犯的非小細胞肺癌患者癌組織中lncRNA LINC00460相對表達對比差異不存統計學意義(P>0.05)，然而不同病理分級的lncRNALINC00460相對表達與淋巴結轉移的存在與否有顯著性差異(P<0.05)。這表明非小細胞肺癌患者的病情惡化程度及lncRNA LINC00460的表達水平正相關，lncRNA LINC00460可能介入了非小細胞肺癌患者的進展，因此下調lncRNA LINC00460表達是臨床治療的新思路。

在多變量COX回歸分析中，lncRNALINC01296的高表達水平，男性，腫瘤直徑，血管侵犯和淋巴結轉移是非小細胞肺癌患者預后不良的獨立預測因子。但該研究未收集有關術后接受放化療者的信息，可能對結果造成一定誤差。后期將擴大樣本量，完善信息收集，進一步研究lncRNALINC01296對非小細胞肺癌患者的臨床意義及作用機制。

綜上所述，lncRNA LINC00460的表達在非小細胞肺癌患者的癌組織中上調，且影響非小細胞肺癌患者預后，是非小細胞肺癌預后的獨立預測因子。