HIF-1α、MITF、CRP、NLR在乙型肝炎病毒感染相關(guān)性肝癌中的表達及其意義

張小芳 劉志良 蔡 勇 黃傳生 羅慶豐

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發(fā)性肝癌的90%以上，而我國是乙肝大國，多數(shù)肝癌患者合并乙型肝炎病毒。HIF-1α體內(nèi)分布廣泛，經(jīng)證實與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，且已經(jīng)成為腫瘤研究和治療的靶點[1]。中性粒細胞與淋巴細胞比值(neutrophil to lymphocyte ratio，NLR)作為炎癥因子的典型代表，是許多惡性腫瘤的研究熱點[2]，它們與HBV感染相關(guān)性肝癌是否有關(guān)，目前研究少有報道。本文通過比較MITF、HIF-1α、CRP及NLR在HBV感染與非感染相關(guān)性肝癌中水平差異，初步探討HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)病機制并尋找其治療靶點。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集我院2016年9月至2018年3月我院初診初治的原發(fā)性肝細胞性肝癌患者97例，平均年齡61歲，男性60例、女性37例，根據(jù)是否感染HPV分為感染組62例、未感染組35例。所有石蠟包埋組織標本均于常溫下10%中性緩沖福爾馬林溶液4～5倍于標本體積中固定12～24 h。患者均為初治，術(shù)前均未接受過放療或化療等治療。所有術(shù)后標本經(jīng)規(guī)范取材后，切片均經(jīng)由兩位高年資經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師按照2015年版《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南》明確診斷，并按Edmondson分級系統(tǒng)按高、中、低分化并完成免疫組化的判讀。同時收集患者相關(guān)臨床病理信息。

1.2 HIF-1α及MITF檢測

收集我院收治的肝癌患者97例手術(shù)標本，每隔1 cm連續(xù)切開；常溫下10%中性緩沖福爾馬林溶液4～5倍于標本體積，固定12～24 h，按“7點”基線取材方案取材。 采用Envsion二步法，同時設(shè)立陽性對照組并將以上組織包埋、切片、脫水，3%過氧化氫室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗3次共9 min，高壓鍋抗原修復(fù)，滴加一抗HIF-1α多克隆抗體(美國)/MITF多克隆抗體(中杉)，37 ℃孵育4 h，PBS沖洗3次，滴加二抗工作液(均為福建邁新)，37 ℃孵育30 min，PBS在組織邊緣反復(fù)沖洗3次，DBA染色15 min，沖洗，復(fù)染，脫水，透明，人工封片后鏡下觀察。

1.3 HIF-1及MITF結(jié)果判定

HIF-1α信號以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃微細顆粒視為陽性，MITF信號以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃微細顆粒視為陽性。根據(jù)腫瘤細胞陽性比例和著色強度綜合制定免疫組化半定量標準陽性細胞記分：每例均隨機觀察3個高倍鏡視野，取平均值。用半定量積分法判斷結(jié)果，每個視野計數(shù)100個細胞，陽性細胞≤ 5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，陽性細胞> 75%為4分；陽性強度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者積分相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判讀由2位病理學(xué)專家獨立評判，最后達成共識。

1.4 C反應(yīng)蛋白的檢測方法

采集所有患者不抗凝的空腹肘部靜脈血各3 ml，靜置2 h，經(jīng)3 000 r/min，離心20 min分離血清(離心半徑16 cm)，取血清置于Eppendorf管內(nèi)冷凍存于-20 ℃保存待檢。實驗步驟、結(jié)果判斷及質(zhì)量控制方法按廠家說明。CRP≥8.2 mg/l判為陽性，測定線性范圍為(0.3～150.0)mg/l。

1.5 NLR的檢測

于術(shù)前1天，清晨采集患者的空腹靜脈血行血常規(guī)檢查，并將血常規(guī)中的中性粒細胞數(shù)值除以淋巴細胞數(shù)值計算得到NLR的比值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MITF在HCC中的表達

通過反復(fù)實驗觀察發(fā)現(xiàn)MITF在肝細胞性肝癌組織中無表達。

2.2 HIF-1α、CRP在HCC中的表達

HIF-1α在HBV感染組中高表達且高于無HBV感染相關(guān)組(卡方值為11.37，P<0.05)，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。CRP值在2組中高表達，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 HBV感染組和未感染組HIF-1α、CRP表達情況(例，%)

2.3 NLR在HPV感染組和未感染組中的比較

NLR在HBV感染組中為3.03±1.84，在HBV未感染組中為2.42±1.83，2組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.073，P>0.05)。

3 討論

我國是肝癌大國，其中病因與患者感染乙肝病毒多年相關(guān)，因此本文選擇以HBV感染相關(guān)的HCC為觀察對象進行研究，可能更符合我國國情及實際的臨床工作。目前，肝癌的治療主要是以手術(shù)為主，而中晚期特別是合并HBV感染的患者，因多合并肝硬化且肝功能不佳，多不能耐受手術(shù)，故治療效果不佳，死亡率高。因此積極探討肝癌的可能致病機制及治療靶點意義深遠。

缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)最初是由 Semenza 在 1991 年發(fā)現(xiàn)的，是1種氧依賴的轉(zhuǎn)錄激活因子，由 HIF-1α和 HIF-1β 2個亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，其中HIF-1α分子大小約為 120 kD，是氧敏感亞基，低氧條件下可被誘導(dǎo)表達并累積[1，3-4]。HIF-1α調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄，如調(diào)節(jié)糖酵解、促進腫瘤細胞增殖、遷移和血管生成[5]，由于其在惡性腫瘤細胞中的特異性表達和HIF在體內(nèi)的廣泛分布，HIF-1α基因正日益成為腫瘤治療研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點課題之一。文獻中HIF-1α在HBV感染相關(guān)性肝癌中的研究較少。通過本課題研究觀察，HIF-1α在HBV感染相關(guān)性肝癌中表達明顯高于沒有合并HBV感染的HCC組，這可能與病毒感染導(dǎo)致的細胞代謝改變，加重細胞缺氧，進而導(dǎo)致疾病的進展相關(guān)。如果能有效地抑制HIF-1a的表達，逆轉(zhuǎn)腫瘤缺氧過程導(dǎo)致的促進腫瘤發(fā)生的或可能為肝癌治療帶來新的機遇。另外，有研究發(fā)現(xiàn)MITF可轉(zhuǎn)錄激活HIF-1α而促進腫瘤血管生成[6]。本課題組經(jīng)反復(fù)實驗證實，盡管MITF可能在部分肝癌細胞培養(yǎng)的細胞系中表達，但是在肝癌的組織中卻未見理想的表達，因此肝癌中HIF-1a的激活可能與MITF的關(guān)系不大。

CRP是機體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥性刺激時肝細胞合成的急性相蛋白，是臨床上常用的急性時相反映指標，后被證實在多數(shù)腫瘤患者的血清中呈高水平表達，其濃度與腫瘤的侵襲和患者的生存率有關(guān)[7]。腫瘤患者血清CRP水平的升高很可能是繼發(fā)于腫瘤壞死、局部組織損傷及炎癥的一個反應(yīng)。CRP的檢測對惡性疾病的評估有重要的臨床價值。NLR可能是反映全身炎癥狀態(tài)的良好指標，與肝細胞癌大小、TNM分期、門靜脈癌栓和AST等臨床病理指標相關(guān)，同時NLR是肝細胞癌肝切除術(shù)患者總體生存的獨立預(yù)后因素[8-11]。HBV感染相關(guān)性HCC中CRP、NLR的表達情況如何，目前文獻報道的較少。本實驗通過觀察CRP、NLR在HBV相關(guān)性肝癌中表達情況來了解該類型肝癌的特點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染HPV組中CRP、NLR均明顯高于未感染HPV組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，HBV感染相關(guān)性HCC機制可能與乏氧相關(guān)，與炎癥反應(yīng)有一定的相關(guān)性。針對HBV感染相關(guān)性HCC的治療可以更多地關(guān)注抑制乏氧過程，兼顧抑制腫瘤發(fā)生中的炎癥反應(yīng)過程。本研究還有許多不足之處，繼續(xù)尋找調(diào)控HBV感染相關(guān)的HCC發(fā)病機制中的關(guān)鍵因子和分子靶點將是肝癌治療的關(guān)鍵。