循環外泌體介導的lncRNA HOXA11-AS通過上調SOX4促進血管內皮細胞增殖

王平，孟立平，劉龍斌，彭放

1.紹興市人民醫院（浙江大學紹興醫院） 心內科，浙江 紹興 312000；2.紹興文理學院附屬醫院（紹興市立醫院） 心內科，浙江 紹興 312000

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD）是嚴重危害人類生命健康的一種疾病，經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）是目前CHD的主要治療手段，但是冠脈支架植入術后支架內再狹窄（in-stent restenosis，ISR）一直是心內科介入醫師所面臨的一個非常棘手的問題。

血管內皮細胞是一層連續覆蓋于整個血管腔表面的扁平細胞，是血管基底膜的重要組成部分，是血管壁與血液間的分界細胞。內皮細胞襯托在血管內壁，具有許多重要的生理功能。完整的內膜可以減少血栓的形成，減少平滑肌細胞的激活從而抑制ISR的形成。最近多項大規模臨床研究結果都顯示，雷帕霉素洗脫支架相比于其他的藥物洗脫支架，其支架內血栓形成的風險增加，有學者懷疑這可能跟雷帕霉素引起內皮細胞損傷有關[4]，并通過基礎研究證實雷帕霉素可以影響內皮細胞膜的結構，增加血小板和血栓黏附在內皮細胞上[5]。GUO等[6]研究結果顯示雷帕霉素在抑制血管平滑肌細胞增殖的同時，也會抑制血管內皮細胞增殖，甚至引起血管內皮細胞的凋亡，從而破壞支架表面血管內膜形成，增加支架內血栓風險。這些研究結果提示在應用雷帕霉素藥物洗脫支架的同時，使用血管內皮細胞保護性藥物，可以減少支架內血栓的形成，降低ISR的發生率。

在本研究中，我們通過隨訪雷帕霉素支架術后患者，根據復查造影結果確認是否發生ISR，收集患者血漿并提取外泌體，用患者血漿外泌體干預經雷帕霉素誘導的內皮細胞增殖抑制模型，觀察循環外泌體對內皮細胞的保護作用及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 內皮細胞和主要試劑 本實驗中采用的人臍靜脈血管內皮細胞系（HUVEC-12細胞）購自上海博湖細胞公司。胎牛血清及RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒購自美國Sigama公司；HOXA11-AS引物由上海吉凱生物科技公司合成，pHOXA11-AS及其相應對照物購自上海吉凱生物科技公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑購自大連TaKaRa公司；CD63、CD9、PCNA、Ki-67、SOX4抗體均購自美國Sant Cruz公司，Western blot相關試劑購自蘇州碧云天生物科技公司。

1.2 實驗分組及干預 細胞實驗首先探索循環外泌體對內皮細胞增殖能力的影響，使用雷帕霉素制作內皮細胞增殖抑制模型，將細胞分為對照組、雷帕霉素組（使用雷帕霉素干預）、雷帕霉素+對照外泌體組（在雷帕霉素干預的基礎上，加入對照組患者血漿外泌體）、雷帕霉素+ISR外泌體組（在雷帕霉素干預的基礎上，加入ISR組患者血漿外泌體）。之后探索lncRNA HOXA11-AS對內皮細胞增殖能力的影響，使用雷帕霉素制作內皮細胞增殖抑制模型，將細胞分為雷帕霉素組（使用雷帕霉素干預），雷帕霉素+pHOXA11-AS（在雷帕霉素干預的基礎上，加入pHOXA11-AS），雷帕霉素+pNS組（在雷帕霉素干預的基礎上，加入空質粒）。

1.3 血漿外泌體的提取及鑒定 收集隨訪2018年6月至2020年6月紹興市人民醫院及紹興市立醫院收治的單支血管病變并植入1枚雷帕霉素支架的患者共426例，有隨訪造影結果的231例，根據是否發生ISR，將患者分為對照組（199例）和ISR組（32例），兩組患者基本臨床資料及病變特征見表1。收集兩組患者的血液，離心獲得血漿后馬上用美國Life公司的Invitrogen外泌體提取試劑盒提取血漿中的外泌體，并在-80 ℃冰箱保存。本研究中所有患者均簽署知情同意書，并由紹興市人民醫院醫學倫理委員會批準通過。將所提取的外泌體先后經2.5%戊二醛、1%鋨酸后固定，再經脫水，環氧樹脂浸透包埋，制成60 nm超薄切片，經鈾、鉛雙重染色，在HITACH500透射電鏡（日本日立公司）上觀察血漿外泌體的形態。血漿外泌體濃度和大小分布的測試使用q Nano（S/N 601A 1405 0338）和納米孔NP100（A38350）。

表1 兩組患者基本臨床資料及病變特征

1.4 Western blot檢測外泌體標志蛋白CD63、CD9和細胞增殖相關蛋白PCNA、Ki67、SOX4的表達情況提取外泌體，加入500 μL蛋白裂解液離心去上清液，用BCA法檢測蛋白濃度。加樣，經電泳蛋白分離和轉膜，于5%脫脂奶粉封閉30 min。一抗孵育，4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。再用二抗常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。用凝膠成像系統顯色曝光，經Quantity One進行灰度測量分析。每組實驗重復3次。

1.5 MTT實驗測細胞增殖能力 取4～7代細胞，胰酶消化后以每孔6×103個接種于96孔板中。細胞貼壁后，饑餓24 h使細胞同步化。各組細胞加入相應的循環外泌體或者pHOXA11-AS等干預因素，每組設3個復孔，2個空白對照孔。細胞在37 ℃、5% CO2孵箱培養6、12、24、48 h后，每孔加入20 μL MTT液，繼續孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，96孔板震蕩10 min，在490 nm波長處用酶標儀測定各孔OD值。最后以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.6 RT-PCR檢測外泌體中lncRNA HOXA11-AS的表達水平 將提取的循環外泌體送至杭州聯川生物技術有限公司檢測進行非編碼RNA芯片分析，得到表達差異的非編碼RNA。TRIzol法提取各組細胞中的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板進行目的基因的擴增。lncRNA HOXA11-AS引物上游：5’-TGCCAAGTTGTACTTAC TACGTC-3’，下游：5’-GTTGGAGGAGTAGGAGTATGTA-3’；以β-actin作為內參，引物上游：5’-GCACCACACCTTCT ACAATGAGC-3’，下游：5’-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA C-3’。反應條件：預變性95 ℃，10 min，變性95 ℃，15 s，退火60 ℃ 60 s，40個循環，各設置3個重復孔，結果以2-△△Ct方法分析。

1.7 統計學處理方法 采用SPSS.20.0和GraphPad Prism7.0軟件進行統計學分析。計數資料用頻數表示，組間比較采用χ2檢驗。計量數據以±s表示，兩組均數間比較用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿外泌體分離及鑒定 提取兩組患者的血漿外泌體后，電鏡結果顯示外泌體呈現典型的茶托樣結構（見圖1A）；q Nano分析結果顯示所提取的外泌體主要集中在20～100 nm（見圖1B）；Western blot結果顯示，相比于血清，我們所提取的外泌體中CD63、CD9這兩個外泌體標志蛋白均有明顯的表達（見圖1C）。上述結果表明本實驗成功的提取了患者血漿中的外泌體。

圖1 血漿外泌體的鑒定

2.2 外泌體抑制內皮細胞增殖 用所提取的ISR患者和對照組患者的血漿外泌體，分別干預經雷帕霉素誘導的血管內皮細胞。熒光顯微鏡下顯示兩組患者中提取的血漿外泌體都可以進入細胞，將外泌體中的物質帶入內皮細胞中（見圖2A）。MTT結果顯示，相比于對照組，雷帕霉素組細胞增殖能力減弱（P＜0.05）；相比于雷帕霉素組，對照組外泌體干預后內皮細胞增殖能力增加（P＜0.05）；而ISR組外泌體無此作用（見圖2B）；Western blot結果顯示，相比于對照組，雷帕霉素組細胞中PCNA和ki-67表達減少（P＜0.05）；相比于雷帕霉素組，對照組外泌體干預后內皮細胞中PCNA和ki-67表達增加（P＜0.05），見圖2C-D。

2.3 外泌體中差異表達非編碼RNA的篩選 非編碼RNA芯片分析結果顯示，與對照組比，ISR組患者血漿外泌體中多種lncRNA的表達發生了變化，其中最明顯的是lncRNA HOXA11-AS（見圖3A）。為了進一步驗證這一芯片檢測結果，采用RT-PCR法檢測了31例對照患者（從199例中隨機抽取）和32例ISR患者血漿外泌體中lncRNA HOXA11-AS的表達情況，發現相比于對照組，ISR患者血漿外泌體中lncRNA HOXA11-AS的表達明顯減少（t=2.71，P＜0.05），見圖3B。

圖2 對照組患者血漿外泌體降低雷帕霉素對內皮細胞增殖的抑制作用

2.4 lncRNA HOXA11-AS促進內皮細胞增殖 用lncRNA HOXA11-AS干預經雷帕霉素誘導的內皮細胞增殖抑制模型，MTT結果顯示，相比于雷帕霉素組，雷帕霉素+pHOXA11-AS組細胞增殖能力增強（P＜0.05）；Western blot結果顯示，相比于雷帕霉素組，雷帕霉素+pHOXA11-AS組細胞中PCNA、Ki-67表達增加（P＜0.05），同時，SOX4的表達增加（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

外泌體是由細胞分泌的具有脂質雙分子層膜結構的生物活性微泡，其直徑一般為40～100 nm，高表達CD63、CD81、TSG101等分子。血液中的外泌體不僅參與了多種疾病的進展，在維持機體正常的生理平衡過程中也有重要作用。RIBEIRO-RODRIGUES等[7]研究發現心肌細胞分泌的外泌體具有保護缺血心肌，促進新生血管形成的作用。GALLET等[8]研究發現部分心梗患者血漿中提取的外泌體具有減少心臟瘢痕，阻止心肌重構的作用。本研究提取了植入雷帕霉素藥物洗脫支架后發生ISR和沒有發生ISR的患者血漿外泌體，并用這些外泌體干預經雷帕霉素處理之后的內皮細胞，發現相較于ISR組，對照組干預后內皮細胞的增殖能力明顯增強。這一結果提示ISR患者和無ISR患者血漿外泌體有差異，并且血漿外泌體可能是通過影響血管內皮細胞的增殖能力而參與了ISR的形成。

外泌體主要是通過包裹在里面的蛋白質、microRNA和lncRNA等小分子發揮生物學功能。 lncRNA雖然不直接參與編碼蛋白質，但是其參與調控機體生命進程中一系列重要過程，包括生長發育、器官形成、骨髓造血、細胞凋亡、細胞增殖等[9]。 在心血管領域中，lncRNA在CHD、高血壓、心臟功能不全等疾病的發生發展中都具有重要的調控作用。BALLANTYNE等[9]研究發現lnc-SMILR在動脈粥樣硬化患者斑塊和血漿中的表達增加，并可以通過促進VSMCs的增殖和遷移從而加速粥樣斑塊的進展。基于這些研究結果，我們猜測在ISR過程中血漿外泌體可能也是通過其中的lncRNA發揮作用。本研究通過基因芯片技術檢測了雷帕霉素藥物洗脫支架植入術后發生ISR以及沒有發生ISR患者血漿外泌體中lncRNA的表達情況，發現7種lncRNA在兩組之間表達差異明顯，ISR組中MAGI2-AS3、lincRNAp21、LOC645166表達增加，ZNF37BP、LOC389906、LINC00189、lncRNA HOXA11-AS表達減少。為了進一步篩選，我們用RT-PCR法檢測了目前已經收集了的雷帕霉素藥物洗脫支架植入后的32例ISR以及31例對照組患者血漿中上述lncRNA的表達情況，發現lnc HOXA11-AS在ISR患者血漿外泌體中表達減少。HOXALL-AS是一個新近被發現并研究的lncRNA，關于此lncRNA的報道主要集中在腫瘤領域。有研 究[13]發現HOXA11-AS與膠質瘤的細胞周期相關，能反映腫瘤的分級，并導致不良的預后。而有研究則提出HOXA11-AS可能通過作用于HOXA11-AS基因來參與宮頸癌的發生[14]。國外的研究報道了HOXA11-AS的表達差異與人卵巢癌及肺腺癌的轉移、侵襲、分期及預后等因素相關，并提出HOXA11-AS對卵巢癌的抑制并非是通過對HOXA11基因的調控來實現的[15-16]。有研究顯示HOXA11-AS可以通過調控miR-140-5p、LATS1、miR-124、PADI2等的表達從而促進腫瘤細胞的增殖[17-21]。上述研究均提示HOXA11-AS具有促進細胞增殖的作用，與上述研究結果相符，本研究結果顯示HOXA11-AS可緩解雷帕霉素對內皮細胞增殖能力的抑制作用。文獻資料表明HOXA11-AS可以促進多種腫瘤細胞的增殖[17-21]，目前尚未見HOXA11-AS對細胞的抑制作用的相關報道，可能HOXA11-AS是一個促進細胞增殖的分子，所以在促進內皮細胞增殖的同時，同樣也會促進平滑肌細胞的增殖，從而降低雷帕霉素對平滑肌細胞的抑制作用，成為促進ISR進展的一個因子，我們將在后續研究中進一步驗證HOXA11-AS對平滑肌細胞增殖能力的作用。

圖3 ISR患者血漿外泌體中lncRNA HOXA11-AS的表達明顯減少

SOX4基因屬于SOX C亞族，主要在胚胎發育過程中的心臟、中樞神經系統、胸腺高表達。此外，SOX4還在一些干細胞和祖細胞中高表達，對干細胞的穩定和分化具有重要的調控作用。研究表明SOX4基因突變、缺失或者過表達不僅會引起先天性疾病，還與腫瘤、心腦血管疾病等的發生發展密切相關。最近的研究還發現SOX4基因的表達與多種腫瘤患者預后相關，并預測SOX4可以作為腫瘤治療的一個靶向位點[22-23]。此外，靶向抑制SOX4的表達可以降低細胞的增殖能力[24-25]。為了進一步探究血漿外泌體抗ISR效應的機制以及HOXA11-AS在其中的作用，我們通過靶基因預測軟件發現lncRNA HOXA11-AS與SOX4具有可能結合的相應位點，并通過Western blot實驗證實lncRNA HOXA11-AS可以促進內皮細胞中SOX4的表達，所以我們推測，血漿外泌體中的lncRNA HOXA11-AS可能是通過上調內皮細胞中SOX4的表達，從而增加內皮細胞的增殖能力。

本研究成功收集并分離出ISR及對照組患者血漿外泌體，發現對照組患者外泌體可以降低雷帕霉素對內皮細胞增殖的抑制作用，并通過基因芯片及RT-PCR篩選出兩組外泌體之間lncRNA HOXA11-AS表達差異。細胞實驗進一步證實lncRNA HOXA11-AS可以降低雷帕霉素對內皮細胞增殖的抑制作用，并同時促進SOX4表達。根據上述結果，我們推測血漿外泌體中的lncRNA HOXA11-AS可能是通過上調內皮細胞中SOX4的表達，從而增加內皮細胞的增殖能力。

A：MTT法測細胞增殖能力；B：Western blot檢測增殖標志蛋白PCNA和Ki-67的表達情況；C：Western blot檢測SOX4的表達情況。與雷帕霉素組比：aP＜0.05 圖4 lncRNA HOXA11-AS促進內皮細胞增殖