lncRNA TTN-AS1靶向抑制miR-1271的表達對肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響及機制

陳哲，王勤寧，黃璐捷，史信寶，胡靜

寧波市醫療中心李惠利醫院，浙江 寧波 315040，1.心胸外科；2.放療科

肺癌具有較高的發病率及病死率，多數患者在確診時已處于中晚期，治療效果及預后不理想[1]。隨著分子生物學的發展，靶向治療成為肺癌治療的新方法，尋找有效的肺癌治療靶點具有重要意義。大 量研究表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）及微小RNA（microRNA，miRNA）與肺癌發生發展及預后密切相關，可作為肺癌診療的特異性靶點[2]。肌聯蛋白反義RNA1（titin antisense RNA1，TTN-AS1）是新近發現的lncRNA，發揮促癌作用，有研究顯示，在甲狀腺癌、食管癌、骨肉瘤等多種腫瘤中lncRNA TTN-AS1異常表達，其表達可促進腫瘤進展[3-5]。有研究顯示，肺癌中TTN-AS1高表達，抑制其表達可降低癌細胞增殖、侵襲和遷移能力[6]。有研究報道，過表達miR-1271可在體內體外抑制肺癌生長[7]；lncRNA TTN-AS1可通過靶向抑制miR-1271促進前列腺癌細胞的增殖和侵襲[8]。TTNAS1和miR-1271都可影響肺癌進展，且lncRNA TTNAS1和miR-1271存在靶向關系，但TTN-AS1是否可通過調節miR-1271影響肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡尚未可知。本研究以肺癌A549細胞為研究對象，旨在探討TTN-AS1調節miR-1271對肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響及可能的分子機制，為肺癌分子水平的治療提供一定的參考及依據。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 DMEM培養基、Opti-MEM培養基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、胎牛血清均購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑盒均購自美國Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒及反轉錄試劑盒均購自日本TaKaRa公司；CCK-8試劑盒購日本Djingo公司；Transwell小室購自美國Corning公司；細胞凋亡試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、RIPA裂解液均購自上海碧云天生物技術有限公司；PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin、cleaved caspase 3和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1 （3-phosphate dependent protein kinase 1，PDK1）抗體購自美國Abcam公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；RT-PCR儀購自瑞士Roche公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；FACScan流式細胞儀購自德國BD Biosicences公司；酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養 人肺癌A549細胞購自美國ATCC。常規復蘇凍存的A549細胞后，使用含10% FBS及1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基，放置于5% CO2、37 ℃培養箱培養。隔天換液1次，待細胞貼壁且占滿80%～90%培養皿面積時進行傳代。實驗選擇處于對數生長期的細胞。

1.3 細胞轉染 采用Lipofectamine 2000進行細胞的轉染。選擇對數生長期的A549細胞，胰酶消化細胞，調整細胞濃度為1×106個/mL，按照2 mL/孔接種于6孔板，于培養箱培養。細胞生長達70%～80%融合時，更換為不含FBS的培養基同步化12 h，隨后進行轉染。使用適量Opti-MEM培養基分別稀釋Lipo 2000、TTN-AS1 siRNA（si-TTN-AS1）及陰性對照（si-NC）、pcDNA-TTN-AS1及空載體（pcDNA）、miR-1271 mimics及miR-NC、miR-1271 inhibitors（anti-miR-1271）及anti-miR-1271。將稀釋后的各轉染組與Lipofectamine 2000混勻，室溫靜置 30 min。將混合液加入6孔板內，于5% CO2、37 ℃培養箱孵育6 h，更換為完全培養基，繼續培養48 h，用于后續實驗研究。

1.4 qRT-PCR檢測TTN-AS1和miR-1271表達 采用TRIzol法提取細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒說明反轉錄為cDNA。將cDNA稀釋10倍，按照熒光定量試劑盒說明進行PCR擴增。每個樣本設置5個重復，相對表達量采用2-△△Ct法計算。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：TTN-AS1：F：5’- CGGGAACAAGCCCTGTG-3’，R：5’-CCGGCCCAAAGATGATG- 3’；GAPDH：F：5’-TGCACCACCACCTGCTTAGC-3’，R：5’- GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’；miR-1271：F：5’-CTAGA CGTCCAGATTGAATAGAC-3’，R：5’-GTCCGAGCTTGGTC-AG AATG-3’；U6：F：5’-CTCGCTT-CGGCAGCACA-3’，R：5’-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3’。實驗重復3次。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖 以5×103個/孔將生長狀態良好且處于對數生長期的細胞接種于96孔板，每孔100 μL細胞懸液，于培養箱常規孵育24 h，按照上述方法轉染，每組設置5個重復。收集轉染48 h的細胞，在每孔加10 μL的CCK-8反應液，混勻，于培養箱繼續孵育4 h。酶標儀檢測波長為450 nm的光密度值（OD值）。實驗重復3次。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲 Transwell小室上室加100 μL的Matrigel基質膠（基質膠:無血清培養基為1:4），待基質膠凝固后進行實驗。收集按照上述分組轉染48 h的各組細胞，胰酶消化細胞，不含血清培養基重懸細胞，并調整細胞濃度為5×105個/mL。取300 μL細胞懸液，加入Transwell小室上室，下室加500 μL含血清的培養基。培養箱正常培養24 h，去掉小室細胞培養液，PBS清洗，棉簽擦凈上室未穿過膜細胞，多聚甲醇固定，0.1%結晶紫染色。倒置顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數穿過膜的細胞數。實驗重復3次。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。收集轉染48 h的各組細胞，胰酶消化細胞，并將細胞濃度調整為5× 105個/mL。預冷PBS洗滌細胞2次，加入binding buffer重懸細胞，離心，棄掉上清液，PBS洗滌細胞2次。加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育20 min。上機檢測前再加入300 μL的binding buffer，1 h內通過FACScan流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.8 Western blot檢測PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達 在轉染48 h 的各組細胞中加適量RIPA裂解液，冰上反應30 min，4 ℃離心，收集上清液。取適量上清液，BCA法檢測蛋白樣品濃度。根據蛋白樣品體積加loading buffer，混勻，100 ℃變性5 min。按照40 μg/孔將變性蛋白加入至SDS-PAGE凝膠（5%濃縮膠和12%分離膠），電泳結束后4 ℃轉PVDF膜1.5 h，加5%脫脂奶粉封閉膜2 h。將膜放置在含PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3（1:1 000稀釋）的孵育盒中，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜。轉移膜至1:2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗中，室溫孵育1 h，洗膜。膜上滴加ECL顯色液，自動凝膠成像系統采集圖像。Quantity One軟件分析各抗體條帶灰度值。實驗重復3次。

1.9 雙熒光素酶報告基因實驗 生物信息學軟件TargetScan預測結果顯示TTN-AS1和PDK1的3’UTR有可與miR-1271結合的位點。構建含結合位點的TTN-AS和PDK1的野生型（WT）及突變型（MUT）3’UTR報告質粒。以5×104個/孔將對數生長期的A549細胞接種于24孔板，待細胞生長達80%融合時，參照Lipofectamine 2000轉染說明，將報告質粒分別與miR-1271 mimics及miR-NC轉染至A549細胞，每組設3個復孔。轉染48 h，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測各組細胞熒光素酶活性。結果以螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性比值表示。

1.10 統計學處理方法 采用SPSS21.0軟件進行分析。計量資料以±s表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抑制TTN-AS1表達對肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響 qRT-PCR結果顯示，轉染TTN-AS1 siRNA的A549細胞TTN-AS1表達明顯低于si-NC組（P＜0.05），表明構建的抑制TTN-AS1表達的A549細胞成功。CCK-8實驗、Transwell實驗及流式細胞術檢測結果顯示，與si-NC組比較，si-TTN-AS1組細胞增殖能力明顯降低，穿膜細胞數明顯下降，凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖1和表1。

圖1 抑制TTN-AS1表達對A549細胞凋亡和侵襲能力的影響

2.2 抑制TTN-AS1表達對A549細胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達的影響 Western blot結果顯示，與si-NC組比較，si-TTN-AS1組PI3K、p-AKT和PCNA表達明顯降低，E-cadherin和cleaved caspase 3表達明顯升高 （P＜0.05）。見圖2。

表1 抑制TTN-AS1表達后的A549細胞增殖、侵襲和凋亡情況

2.3 過表達miR-1271對肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響 qRT-PCR結果顯示，轉染miR-1271 mimics 的A549細胞TTN-AS1表達明顯低于si-NC組（P＜0.05），表明構建過表達miR-1271的A549細胞成功。CCK-8實驗、Transwell實驗及流式細胞術檢測結果顯示，與miR-NC組比較，miR-1271組細胞增殖能力明顯降低，穿膜細胞數明顯下降，凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖3和表2。

圖2 抑制TTN-AS1表達對A549細胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達的影響

2.4 過表達miR-1271對A549細胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達的影響 Western blot檢測PI3K/AKT信號通路及與細胞增殖、侵襲和凋亡相關蛋白表達，結果顯示，與miRNC組比較，miR-1271組PI3K、p-AKT和PCNA表達明顯降低，E-cadherin和cleaved caspase 3表達明顯升高（P＜0.05）。見圖4。

2.5 TTN-AS1可靶向調控miR-1271的表達 生物信息學TargetScan軟件預測結果顯示（見圖5），TTNAS1與miR-1271序列中存在連續的結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示（見表3），miR-1271組野生型TTN-AS1熒光素酶活性較miR-NC組明顯降低（P＜0.05），而突變型TTN-AS1熒光素酶活性較miR-NC組差異無統計學意義（P＞0.05）。qRT-PCR檢測結果顯示（見表4），抑制TTN-AS1表達可明顯上調miR-1271表達，而過表達TTN-AS1可明顯下調miR-1271表達（P＜0.05）。說明lncRNA TTN-AS1與miR-1271存在靶向關系，且可負調控miR-1271表達。

圖3 過表達miR-1271對A549細胞凋亡和侵襲能力的影響

2.6 抑制miR-1271可逆轉抑制TTN-AS1對A549細胞增殖、侵襲和凋亡的影響 各組細胞增殖、侵襲和凋亡檢測結果顯示（見表5），與si-TTN-AS1組比較，si-TTN-AS1+anti-miR-1271組細胞增殖能力明顯降低，穿膜細胞數明顯下降，凋亡率明顯升高（P＜ 0.05）。Western blot檢測結果顯示（見表6），與si-TTN-AS1組比較，si-TTN-AS1+anti-miR-1271組PI3K、p-AKT和PCNA表達明顯升高，E-cadherin和cleaved caspase 3表達明顯降低（P＜0.05）。

表2 過表達miR-1271后的A549細胞增殖、侵襲和凋亡情況

2.7 TTN-AS1可調節miR-1271靶基因PDK1表達生物信息學預測軟件TargetScan預測結果顯示（見圖6），miR-1271和PDK1有可結合的位點。雙熒光素酶報告基因實驗顯示（見表7），miR-1271 mimics與野生型PDK1質粒共轉染熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而與突變型PDK1質粒共轉染熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05）。Western blot結果顯示（見圖7-8），過表達miR-1271和抑制TTN-AS1表達明顯下調PDK1表達，而抑制miR-1271表達和過表達TTN-AS1可明顯上調PDK1表達（P＜0.05）。提示miR-1271與PDK1存在靶向關系，miR-1271和TTN-AS1均可調控PDK1表達。

圖4 過表達miR-1271對A549細胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達的影響

圖5 TTN-AS1的序列含有與miR-1271互補的核苷酸序列

表3 TTN-AS1 WT/MUT與miR-1271 mimics共轉染后的熒光素酶活性

表4 lncRNA TTN-AS1調節miR-1271表達

3 討論

lncRNA是一類不編碼的RNA分子，長度大于200 nt，可在轉錄水平、轉錄后水平及翻譯水平的調控中發揮重要作用。多種腫瘤中lncRNA異常表達，發揮促癌或抑癌作用，參與癌細胞的多種生物學過程[9-10]。lncRNA TTN-AS1是一個促癌基因，在多種腫瘤中高表達，如CHEN等[11]研究顯示，抑制TTNAS1表達可降低胃癌細胞的增殖和侵襲能力；LI 等[12]研究顯示，抑制TTN-AS1表達可降低骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，并促進細胞凋亡。本研究結果顯示，抑制TTN-AS1表達可降低A549細胞增殖和侵襲能力，并促進細胞凋亡。有研究顯示TTN-AS1可通過調節miR-142-5p/CDK5抑制肺癌細胞增殖、侵襲和遷移能力[13]。

表5 抑制miR-1271可逆轉抑制TTN-AS1對A549細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

表6 各組細胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3蛋白相對表達量

圖6 miR-1271的序列含有和PDK1互補的核苷酸序列

表7 PDK1 WT/MUT與miR-1271 mimics共轉染后的熒光素酶活性

圖7 過表達或抑制miR-1271對PDK1蛋白表達的影響

圖8 過表達或抑制TTN-AS對PDK1蛋白表達的影響

近年的研究發現，lncRNA可作為miRNA“海綿”，降低組織及細胞中靶miRNA豐度，降低miRNA對mRNA結合作用及抑制mRNA翻譯，從而增強miRNA靶蛋白表達水平[14]。本研究結果顯示，TTN-AS1和miR-1271存在靶向關系，過表達TTN-AS1可下調miR-1271表達，抑制TTN-AS1表達可上調miR-1271表達。過表達miR-1271可明顯抑制A549細胞增殖和侵襲能力，并促進細胞凋亡，而抑制miR-1271可逆轉抑制TTN-AS1對細胞增殖、侵襲和凋亡的影響。提示TTN-AS1可靶向調節miR-1271影響肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡。PDK1是一個絲/蘇氨酸蛋白激酶，大小為67 kDa，在細胞生長、凋亡、分化等病理生理過程中發揮重要作用[15]。多種腫瘤中PDK1均呈現高表達，可作為一種原癌基因參與腫瘤進展[16-17]。有研究顯示，干擾PDK1表達可通過抑制AKT/FoxO1通路降低肺癌細胞增殖及促進細胞凋亡[18]。miR-1271可通過靶向PDK1調控AKT/MTOR信號通路促進胰腺癌細胞進 展[19]。本研究結果顯示，過表達miR-1271及抑制TTN-AS1均可下調PDK1表達，抑制miR-1271及上調TTN-AS1均可上調PDK1表達。提示TTN-AS1可通過調節miR-1271/PDK1影響肺癌細胞生長。

PI3K/AKT是一條與腫瘤發生發展密切相關的信號途徑，近年研究發現，多種腫瘤中PI3K/AKT信號過度表達和活化[20-21]。AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白，PI3K可通過磷酸化Ser473和Thr308位點刺激AKT的活化，AKT活化后可通過調節下游分子表達，從而影響腫瘤生長[22]。上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）與腫瘤侵襲、轉移密切相關，E-cadeherin是EMT過程的標志物，其表達降低可促進腫瘤的侵襲和轉移[23]。Caspase 3 是凋亡相關的Caspase家族效應蛋白，其活化可促進細胞凋亡[24]。有研究顯示，lncRNA TTN-AS1可通過調控PTEN/PI3K/AKT信號通路影響胃癌進展[25]。 本研究結果顯示，抑制TTN-AS1表達及過表達miR-1271均可下調PI3K、p-AKT和細胞增殖標志物PCNA表達，上調E-cadherin和cleaved caspase 3表達，同時抑制TTN-AS1和miR-1271可逆轉抑制TTNAS1對PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達的影響；lncRNA TTN-AS1可通過靶向調節miR-1271/PDK1并抑制PI3K/AKT信號通路影響肺癌細胞生長。

綜上所述，本研究發現抑制lncRNA TTN-AS1表達可降低肺癌細胞增殖和侵襲能力，并促進細胞凋亡，機制可能與靶向miR-1271/PDK1分子并抑制PI3K/AKT信號通路有關。