4-苯基丁酸類似物的設計合成及對PC12細胞內質網應激與過度自噬的抑制作用

范蘭蘭，孔珊珊，吳彬彬，葉曉霞

溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035

4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，PBA）是一種小分子量的短鏈脂肪酸，是一種被批準用于治療小兒遺傳性尿素代謝障礙、鐮刀形細胞貧血和地中海貧血的臨床藥物[1-2]。2006年有研究報道PBA作為分子伴侶可以通過抑制內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）反應，重塑II型糖尿病鼠血糖穩定[3]。近幾年研究表明，PBA可以通過抑制ERS反應，減少氧糖剝奪后的SH-SY5Y細胞的凋亡[4]，減少原代海馬神經元細胞的損傷[5]、減小骨關節炎關節損傷[6]、減小腦組織缺血性損傷[7]、減少肝細胞損傷和凋亡[8]、治療II型糖尿病[9]、治療特發性肺纖維化或肺動脈高壓[10]等。

本課題組前期研究發現PBA通過抑制GRP78的表達來緩解ERS，但是與正常細胞中的GRP78表達量相比仍然偏高。能否以PBA為模板，改造其結構，尋找到比PBA作用更強的抑制劑呢？我們嘗試設計并合成了11個PBA類似物，并探討其對PC12細胞過度ERS的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器：中科牛津-Quantum-Iplus-400M核磁共振波譜儀（CDCl3或DMSO-d6作溶劑）；LTQ-Velos 液相色譜質譜聯用儀；SHZ-D（III）循環水式真空泵；ZQJ-25手提紫外儀；BSA124S-CW電子天平；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器；XRS+凝膠成像系統；MX190酶標儀；美國Thermo-6N98二氧化碳培養箱；ALLEGRA-64R低溫超速離心機。

1.1.2 試劑：PC12細胞（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤）來源于上海青旗生物科技有限公司，MTT試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；過氧化氫（H2O2，濃度為30%）、DMSO購自美國Sigma-Aldrich公司；GRP78抗體、LC3抗體、GAPGH內參、Marker試劑購自武漢三鷹生物技術有限公司，乙酸乙酯、甲醇、石油醚、毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）、3-甲基腺嘌呤、苯基丁酸等均購自上海阿拉丁生物科技股份有限公司；血清、雙抗、胰酶（含EDTA）以及DMEM培養基均購自中國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 化合物A1-A5 的合成：稱取4-（氨基苯基）丁酸（1 g，5.61 mmol，1 eq）和三乙胺（1.3 mL，16.73 mmol，3 eq）加入至圓底燒瓶內，加入4 mL二氯甲烷，緩慢滴入乙酰氯（1.2 mL，8.36 mmol，1.5 eq），反應30 min，NaHCO3淬滅，經萃取后將水層pH調至中性，干燥得化合物A1。將A1（0.824 g，3.61 mmol，1 eq）和K2CO3（0.990 g，7.23 mmol，2 eq）溶于DMF中，反應30 min加入溴乙烷（815 μL，10.83 mmol，3 eq），萃取純化得A2。將A2（0.657 g，2.63 mmol，1 eq）溶于四氫呋喃中，加入NaH（0.189 g，7.91 mmol，3 eq）反應30 min，再加入碘甲烷（141 μL，7.91 mmol，3 eq），萃取純化得A3。將A3（0.202 g，0.77 mmol，1 eq）溶于2 mL的CH3OH中，加入NaOH（57 μL，3.07 mmol，4 eq），油浴加熱120 ℃和80 ℃回流24 h，分別得到A4和A5（見圖1）

圖1 PBA類似物（A1-A5）合成路線及結構

1.2.2 化合物A6-A9的合成：稱4-（氨基苯基）丁酸 （1 g，5.61 mmol，1 eq）于10 mL無水乙醇中溶解，滴加濃硫酸（891 μL，16.74 mmol，3 eq），油浴加熱70 ℃回流3 h，萃取純化得化合物A6。稱取A6（0.845 g，4.07 mmol，1 eq）于THF中溶解，加入NaH（0.294 g，12.23 mmol，3 eq）反應30 min后，加入CH3I（761 μL，12.23 mmol，3 eq），萃取純化得化合物A7。稱取A7（0.757 g，3.42 mmol，1 eq）于DMF中攪拌溶解，加入K2CO3（1.514 g，10.26 mmol，3 eq）反應30 min后加入CH3CH2Br （771 μL，10.26 mmol，3 eq）或CH3CH2CH2Br （970 μL，10.26 mmol，3 eq），得化合物A8或A9（見圖2）。

1.2.3 化合物A10-A11的合成：將A7（1 g，5.61 mmol，1 eq）于濃硫酸（2.409 mL，45.18 mmol，10 eq）中冰浴攪拌5 min后，滴加濃硝酸（2.034 mL，45.18 mmol，10 eq），反應1.5 h后，冰水淬滅，萃取純化后分別得到化合物A10和A11（見圖3）。

1.2.4 PC12細胞培養：PC12細胞生長于DMEM高糖完全培養基中，培養基中含有熱滅活的10%胎牛血清和1%的抗生素（100 U/mL青霉素，100 mg/mL鏈霉素）中，上述細胞均于37 ℃、含5% CO2的恒溫加濕培養箱中培養，隔天更換新鮮培養基，待細胞快長滿時進行胰酶消化傳代，凍存于-80 ℃冰箱保種。

圖2 PBA類似物（A6-A9）合成路線及結構

圖3 PBA類似物（A10-A11）合成路線及結構

1.2.5 細胞毒性實驗：對數生長期的PC12細胞用0.25%含EDTA的胰酶消化，以5 000個/孔接種于96孔板中，細胞于培養箱中生長24 h后更換新鮮培養基并加入藥物（10 μmol/L）孵育，藥物作用24 h后，在避光條件下，每孔加20 μL的MTT溶液，于細胞培養箱中孵育4 h，4 h后吸掉各孔MTT液并加100 μL的DMSO，震蕩均勻5 min，并用酶標儀在490 nm處測定OD值。存活率百分比計算公式如下：存活率= （OD給藥組-OD對照孔）/（OD溶劑組-OD對照孔）。每孔設3個復孔。

1.2.6 MTT法測定H2O2引起自噬損傷的細胞生存率分析：將處于對數生長期的細胞以5 000個/孔接種于96孔板內，放入培養箱孵育24 h，加入終濃度為10 μmol/L的藥物預保護18 h，再加入終濃度為 0.1 μmol/L的TG損傷24 h，避光條件下每孔加入 20 μL的MTT溶液，于細胞培養箱中孵育4 h，4 h后吸掉各孔MTT液并加100 μL的DMSO，震蕩均勻 5 min，用酶標儀在490 nm處測定OD值。生存率= （OD給藥組-OD對照孔）/（OD溶劑組-OD對照孔）。每孔設3個復孔。

1.2.7 MTT法測定TG引起ERS的細胞生存率分析：將處于對數生長期的細胞以5 000個/孔接種于96孔板內，放入培養箱孵育24 h，加入終濃度為 10 μmol/L的藥物預保護18 h，再加入終濃度為 336 μmol/L的H2O2損傷24 h，避光條件下每孔加入20 μL的MTT溶液，于細胞培養箱中孵育4 h，4 h后吸掉各孔MTT液并加100 μL的DMSO，震蕩均勻 5 min，并用酶標儀在490 nm處測定OD值。生存率= （OD給藥組-OD對照孔）/（OD溶劑組-OD對照孔）。每孔設3個復孔。

1.2.8 Western blot檢測ERS標志蛋白和自噬標志蛋白的表達：PC12細胞以每孔40萬接種于6孔板上，并在37 ℃、含5% CO2培養箱內培養24 h。加藥作用18 h后加雙氧水刺激24 h，在冰上用培養細胞總蛋白提取試劑裂解細胞10 min。12 000 r/min 離心15 min后取上清液測定蛋白濃度并計算出上樣量，等量蛋白樣品（80 μg）在10%或15% SDSPAGE凝膠上分離，并轉移到PVDF膜上。隨后用5%脫脂牛奶封閉，并在4 ℃下用一抗過夜：GRP78抗體（sc-10789，1:1 000）、LC3 II/I抗體（sc-47724，1: 1 000）、Beclin-1（1:1 000）。用1×TBST洗滌3次后，在室溫下用兔二抗孵育1 h，蛋白條帶在ChemiDoc TMXRS+凝膠成像儀中來檢測蛋白表達，條帶灰度值用ImageJ軟件定量分析。

1.3 統計學處理方法 采用GraphPad Prism7.0進行統計學分析。計量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 化合物A1-A11的結構解析

2.1.1 4-（4-(N-methylacetamido)phenyl） butanoic acid（A1）：淡黃色油狀液體，產率：66.7%；IR（cm-1）：3335（N-H），2908（CH2），1712（O= C-OH），1633（O=C-N），1517，1540（苯環骨架振動），1410（C-N），1254（C-O）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ 9.81（s，1H，-COOH），7.46（d，2H，Ar-H），7.08（d，2H，Ar-H），2.49（t，2H，Ar-CH2），2.18（t，2H，-CH2-C=O-OH），2.00（s，3H，CH3-C=O-NH），1.80～1.70（m，2H，-CH2）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 179.45（-O=C-OH），173.24（O=C-NH），142.43，141.31，133.63，124.36（Ar-C），39.03（Ph-C），38.25（-CH2-C=O-OH），31.54（-CH2），29.12（CH3- C=O-NH）。ESI-MSm/z：222.1[M+H]+，與計算分子量吻合。

2.1.2 4-（4-(methylamino)phenyl）butanoic acid （A2）：淡黃色油狀液體，產率：70.8%；IR（cm-1）：3361（N-H），2928（CH2），1717（O=C-O），1687（O=CN），1510（苯環骨架振動），1406（C-N），1174（C-O）。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 7.56（s，1H，-NH），7.40（d，2H，Ar-H），7.10（d，2H，Ar-H），4.12（q，2H，-O-CH2），2.59（t，2H，Ar-CH2），2.29（t，2H，-CH2-C=O-OH），2.14（s，3H，CH3-C=O-NH），1.94～1.88（m，2H，-CH2），1.24（t，3H，-CH3）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 173.53（-O=C-OH），168.38（O=C-NH），137.43，135.99，128.91，120.14（Ar-C），60.27（-O-CH3），34.52（Ph-C），33.60（-CH2-C=O-OH），26.53（-CH2）24.42（CH3-C=O-NH），14.23（-CH3）。ESI-MSm/z：250.2[M+H]+，與計算分子量吻合。

2.1.4 ethyl 4-（4-acetamidophenyl）butanoate （A4）：淡棕色油狀液體，產率：71.2%；IR（cm-1）：3288（N-H），2924（CH2），1700（C=O），1513，1447（苯環骨架振動），1212（C-O）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ 6.97（d，2H，Ar-H），6.59（d，2H，Ar-H），2.74（s，3H，N-CH3），2.55～2.49（t，2H，Ar-CH2），2.26（t，2H，-CH2-C=O），1.83（m，2H，-CH2）。13C NMR （125 MHz，CD3OD）δ 177.69（-O=C-OH），149.41，131.72，130.07，114.26（Ar-C），35.31（-N-CH3），34.34（Ph-C），31.34（-CH2-C=O-OH），28.27（-CH2）。ESI-MSm/z：194.1[M+H]+，與計算分子量吻合。2.1.5 4-（4-acetamidophenyl）butanoic acid （A5）：淡黃色油狀液體，產率：50.7%；IR（cm-1）：2988（CH2），1715（O=C-OH），1684（O=C-N），1540，1508（苯環骨架振動），1457（C-N），1270（C-O）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ 7.30（d，2H，Ar-H），7.20（d，2H，Ar-H），3.22（s，3H，N-CH3），2.70（t，2H，Ar-CH2），2.32（t，2H，-CH2-C=O-OH），1.93（m，2H，-CH2），1.84（s，3H，CH3-C=O-NH）。13C NMR（125 MHz，CD3OD）δ 177.13（-O=C-OH），173.13（O=C-NH），143.55，143.32，131.03，128.06（Ar-C），37.64 （-N-CH3），35.62（Ph-C），34.20（-CH2-C=O-OH），27.75（-CH2），22.29（CH3-C=O-NH）。ESI-MSm/z：236.1[M+H]+，與計算分子量吻合。

2.1.6 ethyl 4-（4-aminophenyl）butanoate（A6）：黃褐色油狀液體，產率：85.4%；IR（cm-1）：3364（NH），2940（CH2），1722（C=O），1517，1448（苯環骨架振動），1176（C-O）。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 6.99～6.93（d，2H，Ar-H），6.62（d，2H，Ar-H），4.12（q，2H，O-CH2），3.49（s，2H，-NH2），2.54（t，2H，Ar-CH2），2.29（t，2H，-CH2-C=O），1.95～1.84（m，2H，-CH2），1.25（t，3H，-CH3）。13CNMR（125 MHz，CDCl3）δ 173.64（-C=O），144.41，131.48，129.26，115.26（Ar-C），60.17（O-CH2），34.29（Ph-C），33.68（-CH2-C=O），26.86（-CH2），14.25（-CH3）。ESI-MSm/z：208.2[M+H]+，與計算分子量吻合。

2.1.7 ethyl 4-（4-(methylamino)phenyl） butanoate（A7）：淡黃色油狀液體，產率：83%；IR（cm-1）：3415（N-H），2941（CH2），1728（C=O），1520，1451（苯環骨架振動），1182（C-O）。1H NMR （400 MHz，CDCl3）δ 7.04～6.97（d，2H，Ar-H），6.59～6.52（d，2H，Ar-H），4.12（q，2H，O-CH2），2.82（s，3H，-N-CH3），2.55（t，2H，Ar-CH2），2.30（t，2H，-CH2-C=O），1.95～1.86（m，2H，-CH2），1.25（t，3H，-CH3）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 173.67（-C=O），147.60，130.19，129.20，112.58（Ar-C），60.15（OCH2），34.26（Ph-C），33.72（-CH2-C=O），30.97（N-CH3），26.92（-CH2），14.25（-CH3）。ESI-MSm/z：222.2 [M+H]+，與計算分子量吻合。

2.1.8 ethyl 4-（4-(ethylamino)phenyl）butanoate （A8）：淡黃色油狀液體，產率：81.1%；IR（cm-1）：3401（N-H），2978（CH2），1731（C=O），1521，1483（苯環骨架振動），1183（C-O）。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 6.99（d，2H，Ar-H），6.56（d，2H，Ar-H），4.12（q，2H，O-CH2），3.14（q，2H，-N-CH2），2.54（t，2H，Ar-CH2），2.30（t，2H，-CH2-C=O），1.90（m，2H，-CH2），1.28～1.22（t，6H，-CH3）。13C NMR （125 MHz，CDCl3）δ 173.67（-C=O），146.68，130.16，129.22，112.93（Ar-C），60.14（O-CH2），38.75（N-CH2），34.26（Ph-C），33.72（-CH2-C=O），26.91（-CH2），14.94（-CH3），14.25（-CH3）。ESI-MSm/z：236.2[M+H]+，與計算分子量吻合。

2.1.9 ethyl 4-（4-(propylamino)phenyl） butanoate（A9）：淡黃色油狀液體，產率：67.7%；IR（cm-1）：3411（N-H），2963（CH2），1732（C=O），1521，1480（苯環骨架振動），1183（C-O）。1H NMR （500 MHz，CDCl3）δ 6.99（d，2H，Ar-H），6.56（d，2H，Ar-H），4.13（q，2H，O-CH2），3.07（t，2H，-NCH2），2.54（t，2H，Ar-CH2），2.31（t，2H，-CH2-C=O），1.90（m，2H，-CH2），1.68～1.60（m，2H，-CH2），1.26（t，3H，-CH3），1.00（t，3H，-CH3）。13C NMR （125 MHz，CDCl3）δ 173.69（-C=O），146.70，130.06，129.22，112.92（Ar-C），60.15（O-CH2），46.15（N-CH2），34.26（Ph-C），33.72（-CH2-C=O），26.92（-CH2），22.77（-CH2），14.26（-CH3），11.62（-CH3）。ESI-MSm/z：250.2[M+H]+，與計算分子量吻合。

2.1.10 ethyl 4-（4-(methylamino)-2-nitrophenyl） butanoate（A10）：明黃色油狀液體，產率：45.3%；IR（cm-1）：3565（N-H），2928（CH2），1717（C=O），1540，1507（苯環骨架振動），1217（C-O）。1H NMR （400 MHz，CDCl3）δ 7.08（d，2H，Ar-H），6.74（s，1H，Ar-H），4.12（q，2H，O-CH2），2.85（s，3H，-NCH3），2.81～2.74（t，2H，Ar-CH2），2.34（t，2H，-CH2-C=O），1.97-1.88（m，2H，-CH2），1.25（t，3H，-CH3）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 173.33（-C=O），150.04（Ar-C-NO2），148.26（Ar-C-NH），132.48，124.16，117.38，106.96（Ar-C），60.30（O-CH2），33.84（Ph-C），31.41（-CH2-C=O），30.55（N-CH3），26.05（-CH2），14.22（-CH3）。ESI-MSm/z：267.1 [M+H]+，與計算分子量吻合。

2.1.11 ethyl 4-（4-(methylamino)-3-nitrophenyl） butanoate（A11）：淡橙色油狀液體，產率：37.9%；IR（cm-1）：3583（N-H），2990（CH2），1728（C=O），1545，15077（苯環骨架振動），1190（C-O）。1H NMR （500 MHz，CDCl3）δ 8.07（s，1H，Ar-H），7.81（d，1H，Ar-H），7.49（d，1H，Ar-H），4.15（q，2H，-OCH2），3.45（s，3H，-N-CH3），2.99～2.95（t，2H，Ar-CH2），2.41（t，2H，-CH2-C=O），2.05～1.99（m，2H，-CH2），1.26（t，3H，-CH3）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 172.93（-C=O），149.67（Ar-C-NH），141.31（Ar-C），134.90（Ar-C-NO2），133.18，122.47，114.34（Ar-C），60.49（O-CH2），33.71（Ph-C），31.78（-CH2-C=O），30.55（N-CH3），25.72（-CH2），14.22（-CH3）。ESI-MSm/z：267.1[M+H]+，與計算分子量吻合。

2.2 化合物A1-A11對細胞毒性的影響 MTT法檢測結果顯示，除化合物A11細胞存活率低于20%外，A1-A10的細胞存活率在100%左右，說明無細胞毒性。并且A1的細胞存活率高于100%，說明有促進細胞增殖的作用，且高于PBA組（P＜0.01），證明其具有較好的細胞保護作用。見圖4A。

2.3 化合物對TG誘導的ERS模型中PC12細胞存活率的影響 在TG誘導的ERS損傷模型中，TG組的生存率約為51%，而A1組的細胞生存率明顯高于TG組和PBA組（P＜0.05），但是A6卻顯示出了毒性，其余化合物在TG損傷模型中未見明顯毒性。見圖4B。

2.4 化合物對H2O2誘導的過度自噬模型PC12細胞存活率的影響 在H2O2誘導的過度自噬損傷模型中，化合物A1、A2、A4和A6-A10組的細胞生存率明顯高于H2O2組（P＜0.05），并且A1、A4、A6和A7組的細胞生存率高于PBA組，然而A2和A10組的細胞生存率低于PBA組（P＜0.05）。見圖4C。

根據以上MTT法檢測結果，綜合考慮化合物A1-A10對ERS和自噬損傷模型中細胞的雙重保護作用結果，我們選取化合物A1、A4、A8通過實驗進一步檢測其對ERS和自噬損傷細胞的保護作用。

2.5 化合物對ERS相關蛋白GRP78表達的影響 Western blot實驗結果顯示，TG組GRP78蛋白表達量高于DMSO組，A1組GRP78蛋白表達量低于TG組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5A-B。

2.6 化合物對自噬相關蛋白Beclin-1和LC3 II/I表達的影響 Western blot檢測結果表明，H2O2組 Beclin-1和LC3 II/I蛋白表達量明顯高于DMSO組，A1組Beclin-1和LC3 II/I蛋白表達量低于H2O2組和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖5C-E。

3 討論

內質網（endoplasmic reticulum，ER）是一種具有重要生理功能的細胞器，參與蛋白質合成、折疊、鈣的儲存和釋放，還參與脂類代謝、類固醇代謝等一系列過程，對維持心肌細胞Ca2+和蛋白質合成穩態具有重要作用[11-12]。缺血缺氧、葡萄糖/營養物質匱乏、ATP耗竭、大量自由基的產生及Ca2+穩態破壞等應激刺激均可引起ER功能障礙，觸發ERS[13-15]。 適度的ERS有利于細胞內鈣和蛋白質加工等穩態的恢復，增強細胞耐受應激剌激的能力；如果ERS持續存在或過強，細胞最終將啟動細胞凋亡程序。ER通路機制是近年來剛發現的一條新的調節細胞凋亡的途徑，是目前研究熱點。研究表明，ER通路誘導的細胞凋亡參與了多種常見疾病，如：神經退行性疾病（阿爾茨海默病、帕金森病等）、糖尿病、心腦組織缺血等的發病過程[16-19]，日益受到重視。

TG常作為ERS的誘導劑，我們選擇TG（0.1 μmol/L） 作為誘導劑，PBA（10 μmol/L）作為陽性對照藥，評估了化合物對TG誘導的ERS模型中損傷細胞的保護作用。細胞自噬是ERS狀態下產生的結果，與許多疾病密切相關，文獻報道，在腦缺血再灌注損傷中，存在過度ERS和過度自噬的雙重損傷病理生理過程，藥物通過抑制ERS和自噬途徑得以大大緩解腦損傷[20]。 因此，本研究同時探究了化合物A1-A10是否具有抑制過度自噬的作用。H2O2常被作為細胞自噬的誘導劑[21]，當H2O2在細胞內含量過高時，則會引起細胞自噬和凋亡[22]。本研究選用H2O2（336 μmol/L）作為自噬的誘導劑，PBA（10 μmol/L）作為陽性對照藥。

GRP78是ERS重要的標志性蛋白之一，抑制GRP78蛋白表達的上調，將會緩解過度ERS，恢復內環境穩態。LC3蛋白來源于自噬體，為自噬的標志性蛋白，自噬發生時LC3 I會被Ag7蛋白活化成LC3 II，LC3 II和LC3 I的比值可用來衡量細胞自噬的水 平[23]，Beclin-1是自噬信號通路上的蛋白，也是檢測自噬水平的重要指標，于是我們采用Western blot法檢測GRP78蛋白和Benclin-1、LC3 II/I蛋白的表達情況。

本研究結果表明化合物（除A11）均無顯著細胞毒性，并且A1細胞存活率優于PBA，具有更好的細胞保護作用；采用MTT法分析化合物在TG誘導的ERS模型中對PC12細胞的生存率的影響，其中化合物A1對ERS損傷細胞具有明顯的保護活性，同時我們發現化合物A1、A2、A4和A6-A10對過度自噬損傷細胞具有保護作用，并且A1、A4、A6和A7對細胞的保護活性優于PBA。基于以上實驗結果綜合考慮，本研究選擇A1、A4和A8通過Western blot法檢測上述化合物對ERS的標志蛋白GRP78和過度自噬標志蛋白LC3 II/I和Beclin-1的表達抑制量，進一步證實設計合成的化合物對ERS和過度自噬的抑制作用；結果表明A1能抑制ERS標志性蛋白GRP78的表達，具有對ERS抑制作用，且A1的抑制作用明顯優于PBA，具備更好的對ERS導致的損傷細胞的保護作用；并且A1能抑制自噬標志性蛋白Beclin-1以及LC3 II/I的表達，且A1的抑制作用明顯優于3-MA，對過度自噬損傷細胞具有更好的保護作用。以上結果表明，設計合成的化合物A1母核PBA相比，對ERS和過度自噬損傷細胞具有更強的雙重保護作用。

圖5 Western blot法檢測GRP78蛋白和Benclin-1、LC3 II/I蛋白的表達情況

本研究合成了11個PBA類似物，并對其進行了ERS和過度自噬的雙重抑制作用研究。首先參考文獻[24]，在PBA的苯環上引入了一個氨基，接著對氨基進行了一系列簡單的結構改造，將A1、A4結構中的羧基乙酯化為A2、A7，A3結構中的酯基水解為羧基得A5，從活性檢測結果表明，A1和A2，A4與A7，A3與A5之間活性相差無幾，說明結構中為羧基還是酯基對活性影響不大；A6的游離氨基改造為甲氨基得A7，A7對ERS導致的細胞損傷保護作用明顯加強，說明對氨基的結構改造也許是活性改變的主要位點，A1活性最強，正是對游離氨基的乙酰化所致；鄰位硝基取代的A11對正常細胞PC12具有明顯毒性作用，細胞存活率下降明顯，我們推測可能是由于化合物中硝基的影響，然而，間位硝基取代的A10對正常細胞PC12無細胞毒性，且對ERS和過度自噬引起的損傷細胞具有保護作用，說明硝基的取代位置對活性具有重要影響作用。

綜上所述，本研究設計合成的11個化合物，合成簡便，通過對PBA簡單的結構改造就獲得活性較其更強的化合物A1-A10，具有較其更好的ERS和過度自噬的雙重抑制作用，對ERS和過度自噬導致的損傷細胞起到保護作用，后續我們將對其進行進一步的深入研究。