胎盤lncRNA H19/miR-675/PPARα與非妊娠期糖尿病巨大兒發生的關系

丁苗苗，倪麗芳，鄭添，俞秋嫣，王玉環，楊新軍

1.溫州醫科大學 公共衛生與管理學院 預防醫學系，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 產科，浙江 溫州 325027

巨大兒（macrosomia）是指任何孕周出生體質量≥4 000 g的新生兒[1]。近年來，我國巨大兒的發生率呈上升趨勢，從2006年的6.5%增加到2016年的7.46%[2-3]，部分地區已達到9.2%[4]。分娩巨大兒不僅會增加產婦發生肩難產、產后出血、陰道撕裂等并發癥的風險[5]，還會增加巨大兒成年后罹患肥胖、糖尿病、心血管疾病等的風險[6]。近年來關于妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）巨大兒的研究較多，且結論較為一致，而非GDM巨大兒發生原因和機制尚不明確。

lncRNA H19是序列長度大于200 nt不編碼蛋白質的長鏈非編碼RNA，可通過其第一個外顯子區域加工產生的衍生物miR-675發揮作用，呈胎盤特異性高表達，是胎盤和胎兒生長發育的關鍵調控基因[7-8]。lncRNA H19/miR-675可調節胎盤生長和滋養層細胞增殖[8-9]，但是否參與非GDM巨大兒的發生發展仍不清楚。我們前期研究發現，過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPARα）在非GDM巨大兒胎盤中表達增加[10]，且有研究報道PPARα可受lncRNA H19/miR-675的靶向調控[11]，因此本研究假設胎盤lncRNA H19/miR-675/PPARα與非GDM巨大兒之間存在一定關系，通過人群研究和細胞實驗兩個角度對其進行探討。

1 對象和方法

1.1 對象 基于2014—2016年在溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院產科建立的孕婦-新生兒隊列，采用巢氏病例對照研究設計，病例組（巨大兒組）為出生體質量≥4 000 g的新生兒，對照組為隨機選擇的出生體質量2 500～3 999 g，且與巨大兒分娩時間相差3 d以內的新生兒。入選標準：正常妊娠、單胎、足月分娩，糖耐量試驗正常。排除標準：有妊娠合并癥者（高血壓、心臟病、肝臟疾病等），有妊娠并發癥（如胎盤異常、胎膜早破、先兆子癇等），新生兒先天畸形。本研究經溫州醫科大學倫理委員會批準，所有產婦均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集：采用自行設計的調查問卷收集產婦和新生兒的基本信息，包括產婦年齡、身高、孕前體質量、孕期體質量增加、分娩方式，新生兒性別、出生體質量及其他相關信息。

1.2.2 胎盤樣品采集和處理：胎盤娩出后，立即無菌操作取胎盤母體面的滋養層組織1 cm3，放入加有RNAlater（美國Ambion公司）的DEPC處理過的凍存管中，4 ℃保存。采集的樣品液氮運輸，并保存于-80 ℃冰箱待檢測分析。

1.2.3 細胞培養和轉染：人絨毛膜滋養層細胞（HTR-8/SVneo）使用含有10%胎牛血清的DMEM培養基，并于37 ℃，5% CO2培養箱孵育。細胞按 lipofectamine 3000說明書的步驟轉染。所用的si-H19序列：5’-CCGUCCCUUCUGAAUUUATT-3’，si-NC序 列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，miR-675-mimic 序列：5’-UGGUGCGGAGAGGGCCCACAGUG-3’，mimic-NC序列：5’-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3’。

1.2.4 胎盤lncRNA H19、miR-675和PPARα的mRNA水平檢測：用TRIzol法提取胎盤及細胞總RNA，反轉錄后進行qPCR檢測胎盤lncRNA H19、miR-675和PPARα的mRNA表達水平，lncRNA H19、PPARα以GAPDH作為內參基因，miR-675以U6作為內參基因。所用引物序列lncRNA H19上游：5’-GGACGTGACAAGCA GGACAT-3’，下游：5’-CATAGTGTGCCGACTCCGTG-3’，產物片段長度為148 bp；PPARα上游：5’-CTATCATTTGC TGTGGAGATCG-3’，下游：5’-AAGATATCGTCCGGGTGGT T-3’，產物片段長度為121 bp。GAPDH上游：5’-CAGGA GGCATTGCTGATGAT-3’，下游：5’-GAAGGCTGGGGCTCATT T-3’，產物片段長度為138 bp。miR-675、U6的反轉錄和qPCR引物均購自廣州市銳博生物科技有限公司。qPCR反應條件為：95℃ 30s，95℃ 5s，60 ℃ 30s，共40個循環。用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

1.2.5 Western blot分析：在細胞轉染24～48 h后提取HTR-8/SVneo細胞的蛋白質，BCA法測定蛋白質濃度，金屬浴100 ℃、5 min變性蛋白質。取等量蛋白質進行SDS-PAGE，將蛋白質轉移到PVDF膜，用10%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST漂洗10 min×3次，PPARα抗體4 ℃搖床孵育過夜，再經TBST漂洗10 min×3次，用二抗（1:5 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次。用化學發光法Bio-Rad凝膠成像系統進行檢測，蛋白質條帶的密度由Quantity One（美國Bio-Rad公司）定量。用GAPDH蛋白進行標準化，檢測細胞總蛋白質中PPARα的表達水平。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS22.0軟件進行數據分析。計量資料若呈正態分布以±s表示，組間比較采用成組t檢驗；非正態分布以M（P25，P75）表示，采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料采用例數和百分比表示，組間比較用χ2檢驗或秩和檢驗。采用logistic回歸分析巨大兒的影響因素，以OR（95%CI）表示各因素對巨大兒發生的危險程度。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 共收集巨大兒55例，對照組58例。兩組間孕前體質量、孕前BMI、孕期體質量增加、孕周、分娩方式、胎兒性別的差異有統計學意義（P＜0.05），產婦年齡、身高、初產婦的比例、巨大兒史在兩組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組產婦及新生兒的基線資料比較

2.2 胎盤lncRNA H19、miR-675、PPARα的mRNA表達水平 巨大兒組胎盤lncRNA H19和miR-675的表達量低于對照組，PPARα的表達量高于對照組，差異均有統計學意義[lncRNA H19：0.89（0.63，1.06）vs.0.97 （0.84，1.30），P＜0.01；miR-675：0.79（0.44，1.05）vs.0.98（0.63，1.47），P＜0.05；PPARα：1.45（1.01，1.92）vs.1.06（0.76，1.44），P＜0.01]，見圖1。

圖1 兩組胎盤lncRNA H19、miR-675、PPARα的mRNA表達水平比較

2.3 胎盤lncRNA H19、miR-675和PPARα表達與非GDM巨大兒發生的關系 考慮潛在影響lncRNA H19、miR-675和PPARα表達差異的混雜因素，采用多因素logistic回歸分析上述三種基因的胎盤表達水平與非GDM巨大兒的關系。在校正孕前BMI、新生兒性別變量后，胎盤lncRNA H19、miR-675和PPARα的mRNA表達仍與非GDM巨大兒的發生風險相關聯，即胎盤lncRNA H19和miR-675的低表達及PPARα高表達均可增加非GDM巨大兒發生的風險，見表2。

表2 胎盤lncRNA H19、miR-675和PPARα的mRNA表達水平與非GDM巨大兒的關系

2.4 細胞水平驗證lncRNA H19/miR-675對PPARα的調控作用 在人絨毛膜滋養層細胞（HTR-8/SVneo）中用siRNA敲低lncRNA H19，結果顯示miR-675表達下調，PPARα的mRNA和蛋白表達水平上調，見圖2A-D。 然而，在HTR-8/SVneo細胞中敲低lncRNA H19，同時過表達miR-675，則PPARα的表達上調被抑制，mRNA和蛋白表達水平與對照組比差異無統計學意義 （P＞0.05），見圖2E-H。

3 討論

本研究分析發現，孕前高BMI和男性新生兒可增加非GDM巨大兒的發生風險，與以往的研究[12]結果一致。此外，在非GDM巨大兒組中孕期體質量增加、孕周高于對照組且差異有統計學意義，表明這些也是影響非GDM巨大兒發生的重要因素。

本研究顯示，在非GDM巨大兒的胎盤組織中lncRNA H19表達水平低于對照組，調整了潛在的混雜因素后，發現胎盤lncRNA H19低表達可增加非GDM巨大兒的發生風險，此研究結果與JIANG等[13]和劉小霄等[14]的報道一致。lncRNA H19是一種父系印跡、母系表達的印記基因，具有限制胚胎發育和減緩子代生長速度的功能[15]，因此當胎盤lncRNA H19表達下調時，可導致胚胎過度發育、加快胎兒的生長速度，從而促進巨大兒的發生發展。有研究報道，lncRNA H19是miR-675的主要前體物[16]，它的第一個外顯子區域加工后可產生miR-675，且胎盤lncRNA H19可通過核糖核酸結合蛋白HuR動態調節miR-675的加工過程，從而影響miR-675的表達，也可進一步通過miR-675發揮其生物學功能[8]。在本研究中，miR-675在非GDM巨大兒的胎盤組織中呈低表達（與對照組相比），可增加非GDM巨大兒的發生風險，此結果與lncRNA H19一致，因此，可以認為胎盤lncRNA H19/miR-675參與了非GDM巨大兒的發生發展。

與對照組比：aP＜0.01圖2 lncRNA H19/miR-675在HTR-8/SVneo細胞水平可調控PPARα的表達

PPARα是過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）家族成員之一，在調節脂肪酸轉運、脂肪酸氧化中發揮重要作用[17]。我們前期研究發現，非GDM巨大兒胎盤組織中PPARα表達增加。進一步通過TargetScan和MiRanda兩種工具，我們發現PPARα是miR-675潛在的靶基因。本研究在校正了孕前BMI、新生兒性別等混雜因素后，發現胎盤PPARα高表達仍可增加非GDM巨大兒的發生風險，且有研究報道在肝臟和心臟組織中PPARα的表達可受lncRNA H19/miR-675的靶向負調控[11，18]，因此在非GDM巨大兒胎盤組織中PPARα的高表達可能部分受lncRNA H19/miR-675低表達的影響。本研究通過構建體外細胞模型，發現在人絨毛膜滋養層細胞（HTR-8/SVneo）中lncRNA H19/miR-675可調控PPARα的表達。綜上，胎盤lncRNA H19/miR-675/PPARα通路可能參與了非GDM巨大兒的發生發展。

本團隊前期研究發現非GDM巨大兒胎盤中脂肪酸轉位酶（FAT/CD36）和膜脂肪酸結合蛋白（FABPpm）等脂肪酸轉運相關的蛋白表達與PPARα一致增 加[19-20]，并與PPARα的表達水平成正相關[10]。研究報道PPARα可通過結合下游靶基因的PPRE元件從而增強脂肪酸轉運相關基因的轉錄[21]，但在非GDM巨大兒胎盤中PPARα是否調控FAT/CD36和FABPpm的表達并影響了脂肪酸轉運仍然不清楚，其具體機制以及PPARα在非GDM巨大兒中的臨床意義需進一步深入研究。

綜上所述，胎盤lncRNA H19/miR-675表達下調，可增加非GDM巨大兒的發生風險。此外，胎盤PPARα表達上調，部分受lncRNA H19/miR-675的調控，胎盤lncRNA H19/miR-675/PPARα與非GDM巨大兒的發生存在一定關系。