碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌在某院的耐藥流行分析①

郭宇航，辛 華，黃昕明，王 勇

(1.佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯市婦幼保健院，黑龍江 佳木斯154004)

近年來，肺炎克雷伯菌為臨床主要檢出的革蘭陰性桿菌，可引起多種細菌感染。碳青霉烯類藥物作為臨床治療革蘭陰性致病菌感染的最后一道防線，廣泛應用于臨床治療。特別是多重耐藥肺炎克雷伯菌的出現，給臨床治療帶來了一定的阻礙。尤其在重癥監護病房的患者中檢出率更高，同時由于該病房的患者年齡大、基礎疾病多、機體免疫力低下等原因，使得CRKP的患者發病率和死亡率都很高。然而，越來越多的碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)被檢出，且呈上升趨勢。本研究旨在分析CRKP耐藥菌株的耐藥情況和分子流行病學特點，為我院的感控工作提供一定的數據支持，同時也可以很大程度上減少耐藥菌的院內傳播。

1 材料與方法

1.1 菌種鑒定與藥敏

對佳木斯大學附屬第一醫院2016～2018年非重復CRKP進行收集，通過VITEK 2 Compact進行藥敏鑒定，耐藥菌株K-B法復核。

1.2 儀器與試劑

藥敏紙片購自英國Oxoid公司，PCR擴增儀為美國Bio-Rad公司，凝膠成像系統為上海領城生物科技公司。

1.3 表型鑒定

碳青霉烯滅活試驗鑒定菌種表型。依據CLSI標準，挑取1μL滿環待檢菌株于肉湯，混勻加入美羅培南紙片，確認紙片完全浸沒肉湯，溫箱孵育4h。挑取ATCC25922單個菌落配制0.5麥氏濁度，涂布MH平板，將孵育后紙片取出貼入MH平板，過夜培養。

1.4 PCR擴增

煮沸法提取菌株DNA，PCR擴增KPC、NDM及OXA-48耐藥基因，引物如下(上海生工合成)(表1)。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳及成像系統觀察后測序比對(哈爾濱博仕生物公司)。

表1 引物序列

1.5 統計學方法

采用WHONET5.6軟件進行統計學分析，統計學方法用χ2檢驗。

2 結果

2.1 鑒定及藥敏

共收集31株符合條件樣本，菌株對亞胺培南、美羅培南及哌拉西林/他唑巴坦耐藥率較高，對左氧氟沙星耐藥率較低，31株CRKP全部對阿米卡星敏感，見表2。

表2 耐藥分析

2.2 表型鑒定結果

表型檢測陽性結果為美羅培南抑菌圈直徑6～15mm或直徑16～18mm但抑菌圈內存在散在菌落。經檢測，31株CRKP中有30株產碳青霉烯酶。

2.3 耐藥基因檢測

30株CRKP全部攜帶KPC-2型碳青霉烯酶基因，1株攜帶NDM型，未檢出OXA-48型。

2.4 CRKP的標本來源

一共收集31株CRKP菌株，主要分離自痰液標本、支氣管沖洗液等標本，見圖1。來源中可以看出CRKP主要分布在下呼吸道標本。

圖1 菌株的標本來源

2.5 實驗菌株的臨床科室分布

31株CRKP菌株主要分離自ICU病房，其次是神經內科，呼吸科等，見表3。

表3 CRKP的科室分布

3 討論

CHINET中國細菌耐藥監測報告顯示，醫院感染細菌以革蘭陰性桿菌為主70.8%，以肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌以及銅綠假單胞菌為主，其中碳青霉烯耐藥菌株檢出率呈快速上升趨勢[1]。碳青霉烯類抗生素以其有效的殺菌功效、廣譜的抗菌特點作為臨床治療革蘭陰性桿菌感染的重要等級藥物，大量不合理的使用針對性地導致耐藥菌株不斷檢出。革蘭陰性桿菌可以“多途徑—快傳播”獲得碳青霉烯耐藥，細菌基因發生替換、插入及缺失等方式改變自身結構以適應抗菌藥物并介導耐藥的垂直傳播[2～4]。眾所周知，CRKP的主要耐藥機制是產生KPC-2型碳青霉烯酶，這種類型的碳青霉烯酶在中國大陸是最常見的類型，我的研究結果也十分符合這個特點，KPC-2型碳青霉烯酶的檢出率也挺高。臨床治療也隨著細菌耐藥機制的變化也有所不同[5]。目前為止，blaKPC已經在中國的許多地區被報道，包括北京，浙江，臺灣和四川[6～9]。除此之外，金屬酶，包括IMP和NDM也會導致腸桿菌科細菌的碳青霉烯抗菌藥物的耐藥，尤其是NDM-1，已經在全球范圍內被檢出，給耐藥菌的治療帶來了威脅。BlaNDM-1首次被報道是來自一個瑞典患者的肺炎克雷伯菌株[10]。BlaNDM-1的快速廣泛傳播主要是由于質粒介導的水平傳播。

本研究針對性分析了CRKP的耐藥情況，結果表明，CRKP對左氧氟沙星以及阿米卡星耐藥率較低，對復合抑制劑及碳青霉烯類藥物耐藥率較高[11]。CRKP主要的耐藥機制為產碳青霉烯酶，CLSI建議采用mCIM初步鑒定是否產酶，研究結果顯示31株CRKP中有30株產碳青霉烯酶，PCR擴增驗證31株CRKP產KPC-2型97%及NDM型酶3%。mCIM表型檢測方法條件簡便、易于操作且與PCR擴增驗證結果大致相符[12]。此外，mCIM結合eCIM還可以用于金屬酶的檢測，2018年CLSI標準建議采用eCIM篩選金屬酶。KPC陽性的肺炎克雷伯菌在我國廣泛流行，1996年首次分離到KPC型菌株，隨后其迅速傳播并在全世界相繼被發現，2014年攜帶KPC-2型腸桿菌科細菌于土耳其一家醫院發現[13]。CRKP可引起多部位、多病種細菌感染，其可用抗生素受限，通常預后不良。相關研究表明CRKP危險因素眾多并且可造成較高的病死率[14,15]。對于重癥監護病房的患者來說，CRKP的定植是隨后發生感染的最主要的危險因素，所以對于耐藥菌定植的主動篩查是非常有用的預防措施，我們通常對于住院患者采集糞便或直腸拭子，然后進行耐藥菌的篩查，從而根據耐藥情況采取一定的預防措施，這樣可以有效地防止耐藥菌的進一步播散。除此之外，經常使用抗菌藥物、ICU住院時間長、血液透析等也成為了CRKP定植的危險因素。我們還需要對醫護人員，特別是ICU的醫護人員進行定期主動篩查，因為耐藥菌可以通過醫護人員進行播散，同時加強醫院環境的定期消毒也十分重要，總之耐藥菌的傳播有許多不同的途徑，我相信只要我們把每一步預防措施都盡力做好，耐藥菌的傳播也會得到遏制。對于CRKP分布在下呼吸道標本居多，可能和臨床細菌培養標本多以留取下呼吸道標本有關。在各標本來源中所占比例還需結合更多的研究數據分析。本院CRKP主要為KPC-2型，表型鑒定結合mCIM可以有效檢測碳青霉烯酶。CRKP耐藥流行情況嚴重，臨床應加強感控措施，合理使用抗菌藥物。然而，我們非常需要建立一個完整的耐藥細菌監測系統，可以及時地發現耐藥菌并且積極地采取預防和治療措施，這樣可以很好地預防耐藥細菌的播散。此外，菌株同源性及耐藥傳播還有待進一步研究。