腸溶緩釋型替米考星固體分散體的制備、鑒定及體外釋放度評(píng)價(jià)

伍濤，唐達(dá)

(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460)

合理規(guī)避替米考星(tilmicosin，TMC)水溶性差、適口性差、毒副作用大和胃刺激性大等缺點(diǎn)[1]，利用緩控釋技術(shù)有效掩蓋其苦味和降低毒副作用，是該藥劑型發(fā)展的新方向[2].本試驗(yàn)綜合考慮替米考星的物理化學(xué)性質(zhì)以及操作簡(jiǎn)單便于工業(yè)化生產(chǎn)等因素，將腸溶性緩釋材料羧甲基乙基纖維素(CMEC)、丙烯酸樹脂(Eudragit L100)和羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP hp55s)作為載體，采用溶劑法制備腸溶緩釋型替米考星固體分散體，對(duì)于控制替米考星在胃腸液中的溶出度，提高替米考星的生物利用度具有重要意義，也為替米考星劑型開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論參考，同時(shí)為該類獸藥的科學(xué)合理使用創(chuàng)造更好條件.

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

替米考星原料(含量94.01%,批號(hào)TMCZ1901011,寧夏泰瑞制藥股份有限公司)；替米考星對(duì)照品(含量93.9%,批號(hào)k0311407,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；市售替米考星腸溶顆粒(含量20%,批號(hào)T1909011,湖北某動(dòng)物藥業(yè)有限公司)；CMEC(廣州錦驊化工科技有限公司)；Eudragit L100(批號(hào)B181103223,德國(guó)EVONIK公司)；HPMCP(浙江德清維康生物科技有限公司)；無(wú)水乙醇、鹽酸、磷酸、氫氧化鈉、二丁胺、甲醇、乙腈等(色譜純,重慶川東化工有限公司).

1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀(型號(hào)agilent1260,安捷倫)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號(hào)OSB-2200,東京理化EYELA公司)；真空干燥箱(型號(hào)DZF-6050型,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；冰箱(型號(hào)BCD-212YM/T,海信容聲冰箱有限公司)；智能溶出試驗(yàn)儀(型號(hào)ZRS-8G,上海圣科儀器設(shè)備有限公司)；多功能X射線衍射儀(型號(hào)XRD-7000S/L型,日本島津)；傅里葉變換紅外光譜儀(型號(hào)IRTracer-100，日本島津)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(型號(hào)DF-101S,鄭州長(zhǎng)城)；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(型號(hào)DFY-400C，無(wú)錫沃信).

1.3 腸溶緩釋型替米考星固體分散體的制備

參考固體分散體的常用制備方法[3]，本研究采用溶劑法制備3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體.

1.3.1 替米考星CMEC固體分散體(TMC+CMEC SD)的制備 精確稱量8 g CMEC到90 mL 90%乙醇-水(v/v)溶液中，50 ℃水浴條件下攪拌至澄明使完全溶解后，緩慢加入2 g替米考星繼續(xù)攪拌45 min，得TMC+CMEC乙醇-水混合溶液.

1.3.2 替米考星Eudragit固體分散體(TMC+Eudragit SD)的制備 精確稱量2 g替米考星和8 g Eudragit L100到80 mL 95%乙醇-水(v/v)溶液中，50 ℃水浴條件下攪拌至澄明使完全溶解后，繼續(xù)攪拌30 min，得TMC+Eudragit乙醇-水混合溶液.

1.3.3 替米考星HPMCP固體分散體(TMC+HPMCP SD)的制備 精確稱量2 g替米考星和8 g HPMCP hp55s到100 mL 80%乙醇-水(v/v)溶液中，50 ℃水浴條件下攪拌至澄明使完全溶解后，繼續(xù)攪拌30 min，得TMC+HPMCP乙醇-水混合溶液.

將上述所得混合溶液分別轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)至粘稠狀態(tài)或形成干燥粉末層(水浴溫度50 ℃，轉(zhuǎn)速40 r/min)，然后迅速倒入預(yù)冷的金屬托盤中，在-20 ℃冰箱中固化24 h，取出置于40 ℃真空干燥箱中干燥18～36 h，徹底除去溶劑.取出粉碎，過(guò)80目篩，放置干燥器避光保存.

1.4 替米考星含量的測(cè)定方法

1.4.1 溶液的配制 磷酸鹽緩沖液：取0.1 mol/L的鹽酸溶液和0.2 mo1/L磷酸鈉溶液，按3∶1混合均勻，必要時(shí)用2 mol/L的鹽酸或2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8.磷酸溶液：取磷酸5.71 g，加水900 mL用12.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至(2.5±0.1)，加水至1 000 mL.供試品溶液：取適量替米考星腸溶性固體分散體粉末(以替米考星計(jì)約0.2 g)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加提取液磷酸鹽緩沖液10 mL，超聲處理15 min，放冷后加乙腈10 mL，再加磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻后即得.對(duì)照品溶液的配制：取替米考星對(duì)照品適量，精密稱定，加乙腈制成每毫升中含0.25 mg的溶液，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用上述磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻后即得.

1.4.2 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠(250 mm×4.6 mm,5 μm)為填充劑；以水-磷酸二丁胺緩沖液[取二丁胺16.8 mL，加磷酸溶液(1→10)70 mL，邊加邊攪拌，放冷后，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至(2.5±0.1)，加水至100 mL](975∶25)為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B.檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；流速為每分鐘1.1 mL.

1.4.3 線性關(guān)系考察 精確稱取替米考星對(duì)照品50 mg，置50 mL容量瓶中，加入乙腈5 mL溶解，加流動(dòng)相至刻度，搖勻備用.分別量取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、5.0及10.0 mL至25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制備濃度分別為0.04、0.08、0.12、0.20、0.40 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為對(duì)照品.將上述各濃度的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，以替米考星溶液的濃度對(duì)峰面積作線性回歸，繪制替米考星標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.4.4 精密度、穩(wěn)定性和回收率試驗(yàn) 精密度試驗(yàn)：精密吸取120 μg/mL對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)量峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值.穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別精密吸120 μg/mL對(duì)照品溶液20 μL于0、2、4、8、10、12及24 h進(jìn)樣，測(cè)量峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值.回收率試驗(yàn)：取替米考星對(duì)照品約0.005、0.010及0.015 g，精密稱定，分別置于50 mL的容量瓶中，加乙腈5 mL溶解，然后加入已知含量的樣品溶液(300 μg/mL)5 mL，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，進(jìn)樣，測(cè)定替米考星的含量，除去樣品本底，計(jì)算回收率及RSD值.

1.5 物象鑒定

參照固體分散體表征手段[4]，將替米考星原料藥和制得的3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體分別進(jìn)行X射線粉末衍射(XRPD)和傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)試驗(yàn).

1.5.1 X射線粉末衍射法 檢測(cè)依據(jù)為JY/T009-1996轉(zhuǎn)靶多晶體X射線衍射方法通則.測(cè)試條件：Cu靶，PIXceIID探測(cè)器，Ni濾波片，電壓40 kV，電流40 mA，角度范圍30°～60°，掃描速度12°/min，取適量樣品填充樣品槽，壓實(shí)刮平，使用正裝法進(jìn)樣，分別進(jìn)行X射線衍射分析.

1.5.2 傅里葉變換紅外光譜法 在紅外光燈照射下，將KBr置入瑪瑙研缽中研磨，直到KBr粉末中呈現(xiàn)出均勻的粉末狀.為了確保紅外圖譜的質(zhì)量，將供試品和KBr以1∶50～100的比例混合均勻，再放入研缽中進(jìn)行研磨.取適量粉末放入壓片機(jī)進(jìn)行壓片，在4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描.

1.6 體外溶出度的測(cè)定

1.6.1 酸中溶出量 分別取替米考星原料、市售替米考星腸溶顆粒和制得的3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體(以替米考星計(jì)約0.5 g)，按照釋放度測(cè)定法[5]，用溶出度測(cè)定法第二法(漿法)裝置，以0.1 mol/L鹽酸溶液750 mL為溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)(37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速75 r/min，依法操作，經(jīng)120 min時(shí)，取樣10 mL，濾過(guò)待檢.

1.6.2 緩沖液中的累計(jì)溶出度 在上述市售替米考星腸溶顆粒和制得的3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體的酸液中加入溫度為(37±0.5)℃的0.2 mol/L磷酸鈉溶液250 mL(必要時(shí)用2 mol/L鹽酸溶液或2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8)，繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)60 min.于2、5、8、10、15、22、30、45、60 min取樣10 mL，濾過(guò)待檢.每次取樣后補(bǔ)充相同釋放介質(zhì)10 mL.采用高效液相色譜法分別測(cè)定峰面積，計(jì)算出不同時(shí)間樣品液的濃度，求算藥物的累積溶出百分率，計(jì)算累積溶出度，繪制溶出曲線.

2 結(jié)果與分析

2.1 含量測(cè)定方法研究結(jié)果

2.1.1 線性關(guān)系考察 線性關(guān)系考察結(jié)果見圖1，線性回歸方程為y=3 604.83x+19 756.99(r2=0.999 5)，替米考星濃度在40～400 μg/mL范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關(guān)系.

圖1 替米考星標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 精密度、穩(wěn)定性和回收率試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，精密度RSD0.64%，穩(wěn)定性RSD0.61%；平均回收率100.12%，RSD1.58%.說(shuō)明本方法測(cè)定精密度和穩(wěn)定性良好，回收率高，可滿足腸溶緩釋型替米考星固體分散體含量測(cè)定要求.

2.2 物象鑒定結(jié)果

2.2.1 X射線粉末衍射分析 檢測(cè)結(jié)果用軟件Origin進(jìn)行繪制，見圖2.經(jīng)X射線衍射表征后發(fā)現(xiàn)，替米考星是一種無(wú)定型物質(zhì)，沒有特征衍射峰出現(xiàn)，只是在低角度處具有一些疊狀衍射峰，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致[6-7].使用不同腸溶性載體制備的替米考星固體分散體分別在9°、17°和23°左右處具有特征衍射峰.說(shuō)明替米考星以無(wú)定形態(tài)分散在載體中，制備的腸溶緩釋型替米考星固體分散體為晶體結(jié)構(gòu).

圖2 腸溶緩釋型替米考星固體分散體XRPD檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 傅里葉變換紅外光譜法分析 如圖3～6所示，替米考星在1 592 cm-1和1 456 cm-1處有中等強(qiáng)度的吸收峰，分別為N-H彎曲振動(dòng)和C-H的不對(duì)稱彎曲振動(dòng)吸收峰.在2 966 cm-1和2 933 cm-1處具有尖銳的吸收峰，分別為-CH2和-CH3的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰.在1 168 cm-1和1 082 cm-1處具有強(qiáng)烈吸收峰，分別為C-O和C-O-C的伸縮振動(dòng).分析發(fā)現(xiàn)，1 592 cm-1和1 456 cm-1的中等吸收峰相對(duì)減弱，2 966 cm-1和2 933 cm-1處的尖銳吸收峰以及在1 168 cm-1和1 082 cm-1處的強(qiáng)烈吸收峰均消失，這說(shuō)明替米考星原料藥已分散于不同載體中.

圖3 替米考星原料FTIR檢測(cè)結(jié)果

2.3 體外溶出度測(cè)定結(jié)果

2.3.1 酸中溶出量 替米考星原料、市售替米考星腸溶顆粒和腸溶緩釋型替米考星固體分散體在120 min時(shí)的酸中溶出量見表1.結(jié)果顯示，替米考星原料幾乎全部溶出(97.46%)，市售替米考星腸溶顆粒溶出量為16.07%，而試驗(yàn)制得的3種固體分散體溶出量分別為8.91%、6.57%和7.04%.因此本試驗(yàn)制得的3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體均符合獸藥典對(duì)腸溶制劑在酸中溶出量小于10%的規(guī)定.

圖4 TMC+CMEC SD的FTIR檢測(cè)結(jié)果

圖5 TMC+Eudragit SD的FTIR檢測(cè)結(jié)果

圖6 TMC+HPMCP SD的FTIR檢測(cè)結(jié)果

表1 腸溶緩釋型替米考星固體分散體的酸中溶出量

2.3.2 緩沖液中累計(jì)溶出度 市售替米考星腸溶顆粒和腸溶緩釋型替米考星固體分散體在2、5、8、10、15、22、30、45、60 min時(shí)的累計(jì)溶出度見表2和圖7.結(jié)果顯示，市售替米考星腸溶顆粒溶出較慢，60 min時(shí)最終累計(jì)溶出度43.31%，有效成分釋放不完全.而試驗(yàn)制備的3種固體分散體在緩沖液中的釋放效果較理想，45 min時(shí)累計(jì)溶出度均達(dá)70%以上，60 min時(shí)最終累計(jì)溶出度分別為71.67%、77.04%和73.87%，有效成分釋放迅速且完全.因此本試驗(yàn)制得的3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體均符合獸藥典對(duì)腸溶制劑在緩沖液中累計(jì)溶出度不低于70%的規(guī)定.

圖7 緩沖液累計(jì)溶出曲線

表2 緩沖液累計(jì)溶出度試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 替米考星口服制劑的胃刺激性問(wèn)題

替米考星對(duì)胸膜肺炎放線菌、巴氏桿菌引起的畜禽呼吸疾病有較理想的治療效果[8-9]，是目前治療該類呼吸道感染用量最大、最常用的藥物之一，該藥的不良反應(yīng)主要是在腸道外給藥時(shí)對(duì)心臟腎臟的毒性作用[10]，因此替米考星口服給藥更安全有效.但替米考星味苦，動(dòng)物拒食情況非常普遍，同時(shí)替米考星口服時(shí)在胃中溶解釋放與胃黏膜接觸，刺激胃黏膜分泌過(guò)多胃液，引起胃出血、胃潰瘍[11].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，替米考星在胃中溶解釋放同時(shí)也會(huì)大大降低其生物利用度[12]，這顯著增加了用藥成本.目前，一些研究人員將替米考星制作成鹽[13]，或者做成微囊[14]、納米乳[15]、包合物[16]等新型制劑，甚至用水溶性載體制備成水溶性替米考星固體分散體[17-18]，雖能不同程度地掩蓋苦味、提高溶解度和生物利用度，但依然沒有真正解決口服替米考星對(duì)胃的刺激性問(wèn)題.

3.2 載體材料的選擇

固體分散體技術(shù)(solid dispersion,SD)是指通過(guò)一定方法使藥物以分子、微晶或無(wú)定形態(tài)高度分散在適宜載體材料中的固態(tài)分散技術(shù)[19].不同載體制備的固體分散體，可表現(xiàn)出不同的溶出特性，親水性載體可增加難溶性藥物的溶出速度和溶解度，并提高藥物的生物利用度；難溶性載體可延緩或控制藥物釋放，使藥物長(zhǎng)效化；而腸溶性載體可控制藥物于小腸中靶向釋放[20].隨著藥劑學(xué)的發(fā)展及新輔料的不斷出現(xiàn)，結(jié)合動(dòng)物生理生化特征和用藥特點(diǎn)，選擇CMEC、Eudragit L100和HPMCP hp55s 3種腸溶性緩釋材料[21-23]作為載體制備腸溶緩釋型替米考星固體分散體，既可掩蓋替米考星苦味，又可靶向在動(dòng)物腸道前端位置定位釋放，有效解決替米考星的胃刺激性問(wèn)題，同時(shí)制得的成品呈粉末狀，可拌料給藥，便于群防群控.

3.3 制備方法的選擇

由于替米考星熔點(diǎn)較高，因此本試驗(yàn)采用溶劑法制備替米考星固體分散體，相對(duì)于流化床包衣法、溶劑-噴霧(冷凍)干燥法等制備固體分散體的新工藝[24-25]，本法具有收率高、步驟簡(jiǎn)易和成本較低的特點(diǎn)，同時(shí)通過(guò)安裝溶劑自動(dòng)回收裝置，可以有效對(duì)溶劑進(jìn)行回收和循環(huán)再利用，進(jìn)一步節(jié)約成本，避免環(huán)境污染.

3.4 體外溶出度測(cè)定的選擇

體外溶出度測(cè)定是篩選緩控釋制劑處方和質(zhì)量控制的重要手段[26]，目前以轉(zhuǎn)籃法和槳法應(yīng)用最廣泛，且均符合2015年版《獸藥典》附錄0931的相關(guān)規(guī)定.槳法攪拌速度雖然與轉(zhuǎn)籃法籃子的轉(zhuǎn)動(dòng)速度一致，但槳法中攪拌槳的擺動(dòng)強(qiáng)度大，攪拌范圍寬，強(qiáng)有力的攪拌更有利于樣品的溶出釋放，因此本研究采用槳法對(duì)替米考星原料、市售替米考星腸溶顆粒和腸溶緩釋型替米考星固體分散體進(jìn)行了體外溶出度的測(cè)定.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)制得的TMC+CMEC SD、TMC+Eudragit SD和TMC+HPMCP SD 3種腸溶緩釋型替米考星固體分散體，通過(guò)XRPD和FTIR物象鑒別試驗(yàn)，驗(yàn)證了替米考星以無(wú)定形態(tài)分散于3種不同腸溶性緩釋載體材料中.3種固體分散體的體外溶出度結(jié)果較為理想，均符合獸藥典中對(duì)腸溶制劑在酸中溶出量小于10%、在緩沖液中累計(jì)溶出度不低于70%的規(guī)定，為替米考星口服新劑型的開發(fā)應(yīng)用提供了理論參考.3種腸溶液緩釋型替米考星固體分散體操作簡(jiǎn)單，具有良好的開發(fā)前景.