CYP19基因在牦牛睪丸及附睪組織中的表達定位

羅文澤，郭憲，胡俊杰，葛聞博，段宏偉

(1.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

牦牛生活在青藏高原海拔3 000 m以上的地區，其對低溫、低氧、低壓的高原環境有較強的適應能力，能充分利用其他家畜難以利用的高山草原，是高原地區牧民的主要經濟來源[1].牦牛全年不補飼，牦牛營養水平不高，造成“夏肥秋壯，冬瘦春乏”的惡性循環，并且缺乏科學的飼養管理模式，因此牦牛3年兩胎或2年1胎的繁殖能力普遍低于其它普通牛屬動物.

哺乳動物睪丸是一個復雜的器官，主要功能是合成睪酮和產生精子.眾所周知，睪丸的正常發育和精子生成的維持是由促性腺激素和睪丸局部分泌的激素控制的[2].除了雄激素外，雌激素對睪丸及附睪發育也有著重要作用，是睪丸發育中主要的系統性調節因子之一.如雌激素通過影響睪丸輸出小管的形態結構和重吸收功能間接影響睪丸的發育和精子發生[3].在哺乳動物睪丸中，雌激素的主要來源是由雄激素通過芳香化酶(P450arom)轉化而來[4]，P450arom在山羊[5]、哥根廷小型豬[6]、大鼠[7]、小鼠[8]、棕熊[9]中均有報道.研究發現，在雄性生殖系統中，包括輸出小管、附睪、睪丸間質細胞、支持細胞與精細胞中亦存在雌激素[10]，雌激素通過影響睪丸輸出小管的形態結構和重吸收功能來間接影響睪丸的發育和精子發生[11].

CYP19基因編碼的芳香化酶P450arom，后者是雌激素合成的最后一步關鍵酶.不同組織中，P450arom的含量和活性及其最終發揮的功能各有不同，這是隨CYP19等位基因頻率變化而改變[12].當CYP19等位基因的發生頻率升高時，P450arom的活性明顯增強，這種基因頻率變化同時伴有血液中雌二醇和睪酮的水平升高[13].因此，睪丸及附睪局部CYP19基因的表達及雌激素的合成對其發育有重要作用.而目前對于CYP19基因在牦牛睪丸及附睪中的表達定位尚不明確，本試驗擬對CYP19在成年牦牛睪丸及附睪中表達進行分析，以期為研究CYP19在成年牦牛生殖中的調節作用提供一定的基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑及試驗動物 4%組織細胞固定液(索萊寶)、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(碧云天)、免疫組化染色試劑盒(博奧森)、中性樹膠(索萊寶)；全蛋白提取試劑盒(強，索萊寶)、SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒(碧云天)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)、P450arom抗體(Abcam)、GAPDH抗體(博奧森)；總RNA提取試劑盒(索萊寶)；反轉錄試劑盒(TaKaRa)；TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus，TaKaRa)；常規試劑等.

以3頭6歲左右的健康青海門源公牦牛作為試驗動物.試驗牛處死后迅速采集睪丸、附睪組織，將部分組織樣分裝于1.5 mL EP管中置于液氮罐中快速冷凍過夜后，轉入-80 ℃超低溫冰箱存放備用，其余部分經固定液(4%多聚甲醛溶液)固定用于免疫組織化學.

1.1.2 儀器設備 熒光定量PCR儀(美國Biodine Rad公司)、瓊脂糖凝膠成像系統(美國Biodine Rad公司)、瓊脂糖水平電泳槽電泳儀(美國Biodine Rad公司)、電子天平(上海精科實業有限公司)、BMJ-Ⅲ型包埋機(常州市中威電子儀器有限公司)、冷凍離心機(德國Ependorff公司)、石蠟切片機(徠卡-2016，德國麥克奧迪實業集團有限公司)、常規儀器等.

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取 常規Trizol法提取樣本總RNA，應用核酸分析儀檢測RNA濃度以及D值，模板選用D值在1.8～2.0之間的RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉錄試劑盒說明書，合成cDNA，以GAPDH基因的特性引物進行電泳，出現亮條帶的cDNA在編號之后，-20 ℃保存，剩余RNA保存于-80 ℃.

1.2.2 引物設計與合成 根據Gen Bank中公布的牦牛CYP19cDNA序列，選用GAPDH為內參基因，用Primer 5.0設計CYP19和GAPDH的引物.使用TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus，TaKaRa)試劑盒進行qRT-PCR.引物送由西安擎科公司合成.

1.2.3 qRT-PCR 使用TB GreenTM Premix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus，TaKaRa)試劑盒進行qRT-PCR，采用20 μL體系在qRT-PCR儀上擴增，設置4個重復組，以保證試驗數據的準確性.程序為:95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s；72 ℃，2 min，共45個循環.每個樣本設置4次重復，以保證樣本中靶基因相對表達的準確性.使用GAPDH作為參照基因如表1，以2-ΔΔCT方法測定CYP19基因的相對表達.

表1 引物信息

1.2.4 Western blot 取出樣品在液氮中研磨成粉末狀，按照30 μg組織粉末加入1.5 mL RIPA裂解液(強)和15 μL PMSF(100 mmol/L)對粉末進行充分震蕩溶解并于冰上放置1 h進行組織裂解；之后使用低溫離心機離心(4 ℃，13 000 r/min，20 min)；離心后吸取上清備用；SDS-PAGE電泳檢測：配制10%的SDS-PAGE膠進行蛋白電泳檢測，并確定最佳的蛋白上樣量進行后續的Western-blot 操作；完成SDS-PAGE操作后，紫外激發后觀察蛋白電泳狀況，之后將此蛋白膠進行轉膜操作，轉膜用的夾子(夾子的黑色部分在最下方)按照海綿-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-海綿-透明夾子部分夾好后用Bio-Rad濕式轉膜裝置進行轉膜操作；將整個裝置放置于大的冰盒中，加入TB-transfer buffer(恒流：400 mA)轉膜2 h；封閉：轉膜完畢后，使用WB Enhancer Solution處理膜 10 min，之后用PBS洗凈，再用5%的脫脂奶粉(用 PBS 配置)封閉液進行封閉，室溫下2 h或者4 ℃封閉過夜；加入P450arom或GAPDH抗體(稀釋度1∶1 000)；洗膜：PBST(PBS+0.1%Tween 20)洗5次，每次5 min；加入二抗：每個目標蛋白的二抗(稀釋度1∶5 000)；洗膜：PBST洗5次，每次5 min后，加入超敏化學發光液處理3～5 min后曝光.

1.2.5 免疫組織化學染色 將包埋的睪丸及附睪組織蠟塊制成厚度4～6 μm的切片后用于免疫組織化學染色.將切片置于40 ℃烘箱中烤片過夜后，根據免疫組化試劑盒(PV-0023、PV-0024，GBI公司，美國)中的操作步驟，切片經脫蠟，脫水，抗原修復，3% H2O2去離子水孵育，PBS洗滌后滴加封閉液室溫封閉30 min，隨后分別滴加一抗(1∶100)和 PBS(陰性對照)，于 4 ℃孵育過夜，洗后滴加二抗并于37 ℃孵育30 min，洗后依次經二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(博奧森生物技術有限公司，北京)顯色、水洗、復染、脫水、透明、封片，并在BA400Digital顯微鏡下觀察拍照.

2 結果與分析

2.1 P450arom在牦牛睪丸及附睪上的表達定位

免疫組化結果顯示：P450arom蛋白在附睪頭、體、尾的上皮細胞、基底細胞、精細胞和平滑肌細胞均有表達.在附睪頭組織中P450arom蛋白主要表達在精細胞和上皮細胞中；在附睪體和附睪尾中P450arom蛋白主要表達在上皮細胞和基底細胞中.在睪丸中，P450arom蛋白主要表達在精原細胞、支持細胞和間質細胞中(圖1).

P450arom：目的蛋白；Control：對照；S：精子；BC：基底細胞；EEC：附睪上皮細胞；LC：間質細胞；SC：支持細胞；Sm：平滑肌細胞；Spg：精原細胞.

2.2 CYP19mRNA在牦牛睪丸及附睪中的表達

熒光定量結果顯示，CYP19mRNA在牦牛睪丸和附睪頭、體、尾中均有表達.CYP19mRNA在睪丸中表達量極顯著高于附睪頭、體、尾(P<0.01)，在附睪體中表達量最低，并且隨著附睪尾、附睪頭、附睪體表達依次遞減(圖2).

以GAPDH為內參基因，表示字母不同表示P<0.01.

2.3 P450arom蛋白在牦牛睪丸及附睪中的表達

Western-blot 結果顯示：P450arom蛋白在牦牛睪丸及附睪頭、體、尾中均有表達.運用Image J 軟件分析得知：P450arom蛋白在附睪頭表達量顯著高于睪丸、附睪體、附睪尾(P<0.05)，而在睪丸、附睪體、附睪尾中表達量無顯著差異(圖3).

以GAPDH作為對照.數據表示字母不同表示P<0.05.

3 討論

根據結構和功能，附睪分為附睪頭、體、尾.睪丸輸出小管及部分附睪管構成附睪頭部，另外一部分附睪管構成附睪的體部與尾部.睪丸輸出小管一端從睪丸網發出，另一端通入附睪管，附睪管中有纖毛結構，纖毛擺動有利于精子運動[14].附睪管管壁有較多平滑肌細胞，可以將精子向下一級管道輸送，附睪管的主要功能是吸收破碎的精子和脫落下來的殘余小體，此外還可分泌甘油磷酸膽堿、唾液酸蛋白等功能[15].精子在曲細精管中尚未完全成熟，還需要附睪的分泌物及一些因子的作用下，發生一系列形態、生理、機能上的成熟過程才具備受精能力，附睪頭、體部是精子發育成熟的部位，尾部是精子貯存的部位，附睪是精子成熟的關鍵部位[16].因此，附睪的主要功能是轉運、儲存精子，并使其成熟.

維持附睪轉運精子和精子成熟功能的主要雄激素是雙氫睪酮，而雙氫睪酮是在5α-還原酶作用下將睪酮轉化而成，雙氫睪酮能夠促進睪丸及附睪的正常發育，以及促進第二性征的出現及維持，對于精子在附睪處的成熟具有重要作用[17].在雄激素的調控下，附睪上皮細胞產生蛋白質、糖蛋白和磷脂，這些對精子的成熟和生存至關重要.缺乏雄激素，睪丸血睪屏障的重塑就會收到阻礙[18].因此，附睪和睪丸主要依賴于雄激素發揮功能.然而，隨著對雌激素的深入研究，發現雌激素對雄性動物生殖亦有重要作用.研究表明雄性動物附睪內也能合成雌激素并且有CYP19基因表達[19].通過CYP19基因編碼的P450arom，雄激素被不可逆的轉化為雌激素，雌激素通過不同的受體途徑及非經典信號通路發揮作用，對雄性生殖具有重要作用.因此，研究P450arom蛋白在附睪中的分布和表達具有重要意義.

本試驗運用免疫組織化學方法發現CYP19在睪丸和附睪頭、體、尾中均有分布表達.在睪丸中主要分布睪丸間質細胞和支持細胞；附睪中主要分布在附睪上皮細胞和部分基底細胞中在這與馬和黃鼠的睪丸和附睪中研究相一致[20-21].這一結果提示牦牛睪丸和附睪有存在合成雌激素的基礎，且在牦牛睪丸及附睪中可能發揮著重要調節作用.

P450arom不可逆的將雄激素轉化為雌激素.本實驗發現CYP19mRNA和蛋白在牦牛睪丸及附睪頭、體、尾中均有表達，mRNA水平在睪丸中表達最高，隨著附睪尾、頭、體依次減弱；蛋白水平在附睪頭表達最高，睪丸、附睪體和附睪尾依次增高.研究表明，在麝鼠中附睪尾部P450arom表達量最高[22]，此外P450arom在小鼠睪丸生殖細胞中也有表達[23]，這和本試驗結果相似，說明CYP19在睪丸和附睪中發揮著重要作用，可能參與調控精子發生、精子成熟和精子儲存.此外，Gunapala等[24]研究表明，雌激素有助于精子發生，Porter等[25]發現雌激素有助于修復精子損傷，Carreau等[26]研究發現，外源性低劑量雌激素可以減少精原細胞凋亡，刺激睪丸精子發生.然而，過量的雌激素抑制睪丸及附睪發育[27].這表明雌激素在精子發生過程扮演著多重角色.雌激素具有抗炎和抗氧化作用[28].適量的外源雌激素可能與保護精子免受氧化、炎癥損傷有關[29].健康男性精液中雌激素含量顯著高于異常組[30].本試驗證實牦牛睪丸和附睪尾中CYP19高表達，這為附睪存在高濃度雌激素存在了可能，并為其儲存提供有利的微環境.然而，本研究中CYP19mRNA和蛋白在睪丸和附睪中的表達結果不一致，這可能是基因在轉錄水平和蛋白翻譯水平存在時空間隔造成的[31].

4 結論

本試驗研究通過研究牦牛的睪丸及附睪頭、體、尾4個部位的CYP19基因的分布和表達，發現各部位均有表達且存在差異，表明這些部位都有合成雌激素的能力.這些結果提示雌激素對雄性牦牛睪丸及附睪的發育有重要意義，為后續牦牛繁殖調控研究提供了一定的基礎.