沙冬青種子總黃酮對小鼠免疫器官淋巴細(xì)胞活性的影響

孫陽，哈小琴，方梅，陳達(dá)年，劉升，張彥平，賈寧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

黃酮類化合物(flavonoids)是2-苯基色原酮的衍生物，廣泛存在于不同種類高等植物的花、果、根、葉及果漿中，主要以苷類存在，少量呈黃酮類糖苷配基的形式存在，已知自然界有8 000多種黃酮類化合物[1-3].已有研究表明，黃酮類化合物不僅毒性較小，且具有多種生物學(xué)活性，包括抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等，具有十分重要的利用和開發(fā)價(jià)值.

沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)是一種旱生豆科植物，屬亞洲荒漠地區(qū)獨(dú)有的常綠灌木.目前已知僅有A.mongolicus和A.nanus兩個(gè)品種.沙冬青在我國主要分布于新疆、甘肅、青海和內(nèi)蒙古的荒漠地帶.前期試驗(yàn)研究表明[4-6]，黃酮類化合物是沙冬青種子中含量較高的成分之一，分離提取的沙冬青種子總黃酮在抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等方面都顯示出良好的特性，具有十分重要的利用和開發(fā)前景.因此，為進(jìn)一步探索沙冬青種子總黃酮對機(jī)體免疫活性細(xì)胞-淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，本研究采用CTX(環(huán)磷酰胺)復(fù)制小鼠免疫抑制模型，探索沙冬青種子總黃酮對免疫抑制小鼠免疫器官中淋巴細(xì)胞活性的影響，從而為沙冬青種子總黃酮的開發(fā)利用提供重要的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙冬青種子：購自甘肅省武威市農(nóng)墾種子公司，清洗干凈、曬干、粉碎機(jī)粉碎.沙冬青種子總黃酮：由甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(蘭州畜牧與獸藥研究所)提取與純化，其純化物總黃酮含量達(dá)86%以上.

環(huán)磷酰胺(美國Sigma公司)；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1052)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；蛋白酶K(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；甲基綠染液(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)；CD20(bs-4869R)和CD3(bs-10498R)(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)；抗體稀釋液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；廣譜SP免疫組化試劑盒(美國Sigma公司產(chǎn)品).其余試劑為國產(chǎn)分析純.

1.2 動(dòng)物分組及試驗(yàn)

50只20日齡清潔級(jí)昆明種小鼠(18～21 g)及鼠料，均購自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.小鼠常規(guī)飼養(yǎng)于潔凈動(dòng)物房內(nèi)(22 ℃、自然光照、自由采食)適應(yīng)3 d.隨后，進(jìn)行試驗(yàn)分組.

50只試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為空白組(對照組)、免疫抑制組、黃酮Ⅰ組、黃酮Ⅱ組及黃酮Ⅲ組，每組10只(雌雄各半).分組后進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn).

動(dòng)物試驗(yàn)共計(jì)4周(28 d).第1周(前7 d)，空白組(對照組)小鼠灌胃生理鹽水0.6 mL/d，其余4組(免疫抑制組、黃酮Ⅰ組、黃酮Ⅱ組及黃酮Ⅲ組)小鼠均灌胃CTX(環(huán)磷酰胺)0.6 mL，灌胃劑量40 mg/(kg·d).第2～4周(后21 d)，空白組(對照組)小鼠繼續(xù)灌胃生理鹽水0.6 mL/d；免疫抑制組小鼠改灌胃生理鹽水0.6 mL/d；黃酮Ⅰ組小鼠改灌胃沙冬青總黃酮0.6 mL，灌胃劑量50 mg/(kg·d);黃酮Ⅱ組小鼠改灌胃沙冬青總黃酮0.6 mL，灌胃劑量150 mg/(kg·d);黃酮Ⅲ組小鼠改灌胃沙冬青總黃酮0.6 mL,灌胃劑量250 mg/(kg·d).末次灌胃結(jié)束24 h后，檢測相關(guān)指標(biāo).

1.3 臟器指數(shù)測定及樣品采集

對小鼠進(jìn)行解剖，分別采取胸腺和脾臟，剔除表面結(jié)締組織和脂肪、稱質(zhì)量，分別計(jì)算小鼠胸腺和脾臟指數(shù)：

A(胸腺指數(shù))=胸腺質(zhì)量/空腹體質(zhì)量

B(脾臟指數(shù))=脾臟質(zhì)量/空腹體質(zhì)量

臟器指數(shù)測定完成后，立即采用生理鹽水清洗小鼠胸腺和脾臟表面的血污，用濾紙吸干，置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mol/L pH7.4)固定14 d.

1.4 石蠟切片制作與觀察測定

胸腺和脾臟材料固定結(jié)束后，用鋒利刀片分別切取胸腺和脾臟組織塊(1 cm×1 cm×0.2 cm)，流水清洗12 h.常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，制備連續(xù)切片(3～4 μm)，每隔5張切片取1張，共取5張.常規(guī)HE染色，二甲苯透明，中性樹脂封片.采用Olympus BX-UCB/BX61 圖像分析系統(tǒng)觀察、拍照；同時(shí)，每張切片不同方向隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用圖片分析軟件(image-pro express)，進(jìn)行胸腺皮質(zhì)和脾臟白髓面積的測定.

1.5 淋巴細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL顯色法)與計(jì)數(shù)

將胸腺和脾臟石蠟切片常規(guī)脫蠟后，按試劑盒說明書操作.在濕盒中用蛋白酶K修復(fù)(30 min)，采用3%H2O2滅活過氧化物酶(20 min)，PBS清洗3次.采用生物標(biāo)記液(TdT酶和Biontin-dUTP)覆蓋組織，37 ℃孵育1 h，PBS清洗.然后，分別采用標(biāo)記反應(yīng)終止液孵育10 min、Streptavidin-HRP工作液孵育30 min，進(jìn)一步采用DAB染色顯示淋巴細(xì)胞凋亡，用甲基綠顯示正常細(xì)胞.最后，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片.按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書判定，切片中呈黃色細(xì)胞(淺黃色至棕黃色)為凋亡陽性細(xì)胞.采用顯微圖像分析系統(tǒng)(Olympus BX-UCB/BX61)觀察、拍照，對每張切片不同方向隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù).

1.6 免疫組化SP法檢測CD3與CD20陽性細(xì)胞平均光密度

將胸腺和脾臟石蠟切片常規(guī)脫蠟后，置切片于微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS清洗，滴加3%H2O2覆蓋組織，PBS清洗，滴加山羊血清覆蓋組織，置于37 ℃溫箱孵育15 min，PBS清洗，滴加一抗(單克隆抗體，稀釋濃度為1∶250)，置于4 ℃冰箱中過夜，陰性對照采用PBS緩沖液代替一抗.PBS清洗，滴加二抗(山羊抗小鼠，CD3稀釋濃度為1∶300；CD20稀釋濃度為1∶400)，置于37 ℃溫箱孵育30 min，PBS清洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，置于37 ℃溫箱孵育30 min，PBS清洗，用DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，中性樹脂封片.每張切片不同方向隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用圖片分析軟件(image-pro express)分別測定視野平均光密度值.

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫抑制小鼠模型復(fù)制

臟器指數(shù)測定結(jié)果顯示(表1)，免疫抑制組小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)分別為(2.26±1.25)mg/g、(1.50±0.34)mg/g，顯著低于對照空白組(P<0.01；P<0.05)，表明免疫抑制小鼠的免疫器官發(fā)育受到明顯阻礙.同時(shí)，淋巴細(xì)胞凋亡檢測顯示(表1，圖1)，環(huán)磷酰胺(CTX)誘導(dǎo)了免疫器官淋巴細(xì)胞的凋亡，與空白組比較，免疫抑制組小鼠脾臟和胸腺中淋巴細(xì)胞顯著凋亡，其凋亡細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白組(P<0.01).上述結(jié)果證明，CTX對小鼠脾臟和胸腺生長與發(fā)育產(chǎn)生了明顯的抑制作用，并且這種抑制作用是通過誘導(dǎo)脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的，CTX成功復(fù)制了小鼠免疫抑制模型.

A：脾臟空白對照組(1 000×)；B：脾臟免疫抑制組(1 000×)；C：胸腺空白對照組(1 000×)；D：胸腺免疫抑制組(1 000×)；黃色為凋亡細(xì)胞，數(shù)量在免疫抑制組小鼠胸腺和脾臟中凋亡淋巴細(xì)胞顯著增多.

表1 小鼠免疫抑制模型與空白對照的比較

2.2 沙冬青種子總黃酮對免疫抑制小鼠胸腺和脾臟結(jié)構(gòu)的影響

由表2和圖2可以看出，免疫抑制組小鼠胸腺皮質(zhì)面積為(15.42±1.16)μm2，脾臟白髓面積為(14.14±1.00)μm2，其數(shù)值均顯著低于對應(yīng)對照組(P<0.01).與免疫抑制組比較，黃酮Ⅰ組、黃酮Ⅱ組和黃酮Ⅲ組小鼠胸腺皮質(zhì)和脾臟白髓面積都程度不等的增加，尤其黃酮Ⅱ組(沙冬青總黃酮灌胃劑量150 mg/(kg·d)小鼠胸腺皮質(zhì)和脾臟白髓面積增加最突出，分別達(dá)到(83.11±1.25)μm2和(47.00±1.55)μm2，差異極顯著(P<0.01).比較組織學(xué)觀察，免疫抑制組小鼠胸腺皮質(zhì)和脾臟白髓出現(xiàn)不等程度的萎縮，淋巴細(xì)胞排列稀少.黃酮Ⅱ組小鼠胸腺皮質(zhì)和脾臟白髓淋巴細(xì)胞明顯增多，淋巴細(xì)胞排列緊密，組織結(jié)構(gòu)界限清晰.表明沙冬青種子總黃酮具有促進(jìn)免疫抑制小鼠胸腺和脾臟中淋巴細(xì)胞增殖的作用.

表2 沙冬青種子總黃酮對小鼠胸腺皮質(zhì)和脾臟白髓面積的影響

A：胸腺免疫抑制組，HE×200；B：胸腺黃酮Ⅱ組，HE×200；C：脾臟免疫抑制組，HE×200；D：脾臟黃酮Ⅱ組，HE×200；與免疫抑制組比較，黃酮Ⅱ組中，小鼠胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增多.

2.3 沙冬青種子總黃酮對免疫抑制小鼠CD3陽性淋巴細(xì)胞的影響

免疫組化CD3陽性淋巴細(xì)胞分析顯示(表3，圖3)，免疫抑制組小鼠脾臟和胸腺CD3陽性淋巴細(xì)胞的平均光密度值僅為(0.14±0.01)A/mm2(脾臟)和(0.19±0.01)A/mm2(胸腺)，顯著低于對照組(P<0.01).黃酮Ⅰ組、黃酮Ⅱ組和黃酮Ⅲ組小鼠脾臟和胸腺的CD3陽性淋巴細(xì)胞平均光密度值都有程度不等的增加，尤其黃酮Ⅱ組(沙冬青總黃酮灌胃劑量150 mg/(kg·d))小鼠胸腺和脾臟CD3陽性淋巴細(xì)胞平均密度值增加最明顯，高達(dá)(0.46±0.04)A/mm2、(0.28±0.06)A/mm2，與免疫抑制組比較差異極顯著(P<0.01)，此外，與空白對照組比較差異也極顯著(P<0.01).已有研究表明，T淋巴細(xì)胞膜表面均高表達(dá)CD3分子，免疫器官CD3陽性淋巴細(xì)胞平均光密度值的增大表明組織中T細(xì)胞的增殖.因此，結(jié)果表明，沙冬青種子總黃酮顯著促使了免疫抑制小鼠胸腺和脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖.

A：脾臟免疫抑制組，400×；B：脾臟黃酮Ⅱ組，400×；C：胸腺免疫抑制組，400×；D：胸腺黃酮Ⅱ組，400×；褐色為CD3陽性細(xì)胞，與免疫抑制組比較，黃酮Ⅱ組中，小鼠胸腺和脾臟CD3陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多.

表3 沙冬青種子總黃酮對小鼠胸腺、脾臟CD3細(xì)胞增殖的影響

2.4 總黃酮對免疫抑制小鼠CD20陽性淋巴細(xì)胞的影響

由表4和圖4可知，免疫抑制組小鼠脾臟和胸腺CD20陽性淋巴細(xì)胞平均光密度值僅為(0.16±0.07)A/mm2(脾臟)和(0.13±0.01)A/mm2(胸腺)，顯著低于對照組(P<0.01).黃酮Ⅰ組、黃酮Ⅱ組和黃酮Ⅲ組小鼠脾臟和胸腺的CD20陽性淋巴細(xì)胞平均光密度值都有程度不等的增加，尤其黃酮Ⅱ組(沙冬青總黃酮灌胃劑量150 mg/(kg·d))小鼠胸腺和脾臟CD20陽性淋巴細(xì)胞平均密度值增加最明顯，高達(dá)(0.37±0.03)A/mm2、(0.43±0.07)A/mm2，不僅與免疫抑制組比較差異極顯著(P<0.01)，而且與空白對照組比較也差異極顯著(P<0.01).已有研究表明，在B淋巴細(xì)胞膜表面均高表達(dá)CD20分子，免疫器官CD20陽性淋巴細(xì)胞平均光密度值的增大表明組織中B細(xì)胞的增殖.結(jié)果表明，沙冬青種子總黃酮也顯著促使了免疫抑制小鼠胸腺和脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖.

A：脾臟免疫抑制組，400×；B：脾臟黃酮Ⅱ組，400×；C：胸腺免疫抑制組，400×；D：胸腺黃酮Ⅱ組，400×；褐色為CD20陽性細(xì)胞，與免疫抑制組比較，黃酮Ⅱ組中，小鼠胸腺和脾臟CD20陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多.

表4 沙冬青種子總黃酮對小鼠脾臟、胸腺CD20細(xì)胞增殖的影響

3 討論

已有研究表明[9-13]，環(huán)磷酰胺(CTX)是一種非特異性抗腫瘤和免疫抑制性藥物，CTX可使小鼠胸腺和脾臟指數(shù)降低，從而導(dǎo)致小鼠免疫抑制.本研究也進(jìn)一步證實(shí)，CTX可誘導(dǎo)小鼠胸腺和脾臟指數(shù)顯著降低.同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，CTX免疫抑制組小鼠脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞的凋亡數(shù)量顯著高于空白對照組，說明其誘導(dǎo)小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的降低，是通過誘導(dǎo)胸腺和脾臟中的重要功能細(xì)胞-淋巴細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的.有學(xué)者認(rèn)為[9-10]，CTX可通過破壞細(xì)胞DNA，阻止DNA的復(fù)制導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡.有關(guān)CTX誘導(dǎo)小鼠胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的深入機(jī)理還有待進(jìn)一步研究.

淋巴細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體重要的免疫功能細(xì)胞，其在動(dòng)物機(jī)體免疫應(yīng)答(細(xì)胞免疫和體液免疫)中均扮演著重要的角色.已有研究表明[14-19]，CD3是T淋巴細(xì)胞的特有標(biāo)志物，并在T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜上高表達(dá)，而T淋巴細(xì)胞在機(jī)體細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用.CD20是B淋巴細(xì)胞特有的表面因子，并在B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜表面高表達(dá)，而B淋巴細(xì)胞在機(jī)體體液免疫中發(fā)揮重要作用.因此，CD3陽性T淋巴細(xì)胞和CD20陽性B淋巴細(xì)胞的共同增殖，可大大增強(qiáng)和改善機(jī)體的天然免疫機(jī)能.本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沙冬青種子總黃酮可促使免疫抑制小鼠脾臟和胸腺CD3陽性T淋巴細(xì)胞和CD20陽性B淋巴細(xì)胞平均光密度值的大大增加，也表明免疫抑制小鼠脾臟和胸腺T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多.由于T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量增多使富含淋巴細(xì)胞的小鼠胸腺皮質(zhì)區(qū)和脾臟白髓區(qū)的面積相對于免疫抑制小鼠顯著增加，進(jìn)一步證明，沙冬青種子總黃酮促進(jìn)了免疫抑制小鼠脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞的增殖，從而顯著增強(qiáng)和改善了免疫抑制小鼠的免疫功能.

4 結(jié)論

綜上所述，沙冬青種子總黃酮可顯著促進(jìn)免疫抑制小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖，修復(fù)受損免疫器官，從而改善和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能.