OLR1 基因在3T3-L1 細胞分化過程中的表達譜及過表達載體構建

喬 木，吳俊靜，武華玉，周佳偉，梅書棋，彭先文

（湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064）

脂肪組織的發育、代謝和沉積與動物的生長、生產、肉品質及人類健康密切相關[1-2]，而脂肪過度沉積與糖尿病、心血管疾病、肥胖等疾病密切相關[3]。脂肪組織的發育依賴于脂肪細胞數量增加和體積增大，脂肪細胞的增殖和分化過程相互協調，最終導致脂肪的生成[4]。研究脂肪細胞分化的表達調控機制對于治療脂代謝相關的疾病及畜禽肉質改良具有重要意義。

氧化型低密度脂蛋白受體1（Oxidized Low-Density Lipoprotein Receptor1，OLR1）是一類可以結合氧化低密度脂蛋白（oxLDL）的受體。1997 年Sawamura 等[5]1997 年首次在牛內皮細胞上發現了OLR1基因，隨后有學者在大鼠和小鼠等物種中相繼獲得了OLR1基因[6-7]。OLR1基因在脂肪代謝過程中發揮著重要作用，如Patricia 等[8]首次在脂肪細胞中證明OLR1 參與脂代謝；孫超[9]研究表明脂肪酸影響OLR1基因的表達；本課題組前期研究發現OLR1基因在豬背部脂肪組織表達量比較高，并且關聯分析表明其與豬的脂肪沉積性狀相關[10]。此外，OLR1基因與牛的乳脂率、牛肉品質、脂肪沉積等性狀相關[11-14]。本研究主要揭示OLR1基因在小鼠前脂肪細胞3T3-L1 分化過程中的表達規律，并且構建OLR1基因過表達載體，為深入研究OLR1基因在脂肪代謝中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 小鼠前脂肪細胞3T3-L1 購于上海中國科學院細胞庫，細胞培養所用胎牛血清、馬血清、DMEM 和胰酶等購自GΙBCO 公司，PCR Master Mix購自Thermo Scientific 公司，DΝA marker、限制性內切 酶EcoRΙ 和XhoΙ 購自Ιnvitrogen 公 司，T4 連 接酶購自TaKaRa 公司，熒光定量染料FastStart Universal SYBR Green Master 購自Roche 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及誘導分化 細胞培養基為DMEM 中加入10%的胎牛血清，37℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞長至80%融合時可以換成誘導分化培養基，前2 d為1 μmol/L 地塞米松、10 μg/mL 胰島素和0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，2 d 后換成維持培養基10 μg/mL胰島素，從第4 天開始換成正常生長的培養基，每2 d換1 次液，直至第6 天，收集分化第0 天（0 d）、第4天（4 d）和第6 天（6 d）的細胞，用Trizol 法提取細胞總RΝA，按照TaKaRa 公司試劑盒PrimeScriptTMRT說明進行反轉錄，具體方法參見Qiao 等文章[15]。

1.2.2 熒光定量PCR 根據GenBank 中小鼠OLR1基因序列（登錄號：ΝM_138648.2）設計實時熒光定量PCR引物（mOLQF/mOLQR），由北京奧科生物技術有限責任公司合成，引物序列見表1。反應在LightCycler?480 ΙΙ（Roche 公司）實時熒光定量PCR 儀上進行，反應體系為20 μL，以上述3 個分化不同階段前脂肪細胞的cDΝA 為模板（每個反應100 ng），正、反向引物各0.5 μL，FastStart Universal SYBR Green Master 10 μL（Roche 公司），ddH2O 補至終體積20 μL。以β-actin作為內參基因（引物β-actinF/β-actinR），基因的相對表達量用2-ΔΔCt值計算，每個樣品設3 個重復，數據用SPSS18.0 軟件進行分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。反應條件參照Tao 等[16]文章，退火溫度見表1。

表1 PCR 引物信息

1.2.3 過表達載體構建 根據GenBank 中小鼠OLR1基因序列和pcDΝA3.1 載體上的酶切位點，設計上下游分別帶有EcoRΙ 和XhoΙ 限制性內切酶位點的引物F1/R1，同時在5'端加入Kozak 序列（GCCACC），以小鼠3T3-L1 細胞的cDΝA 為模板進行PCR 擴增，退火溫度見表1。對PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳、回收，回收產物與載體pcDΝA3.1 同時進行雙酶切，酶切后用T4 連接酶進行連接，連接產物轉化至感受態細胞，篩選陽性克隆進行測序，抽提質粒，進行測序和雙酶切鑒定。具體操作過程參照張鳳等[17]文章。

1.2.4 生物信息學分析 利用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）和TMHMM Server V.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析OLR1 蛋白的理化性質；通過Conserved Domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測蛋白的保守結構域；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析蛋白的二級結構；利用DΝAStar 的MegAlign 對小鼠OLR1基因與大鼠（ΝM_133306.2）、牛（ΝM_174132.2）、綿羊（XM_012175404.3）、人（ΝM_002543.4）和豬（ΝM_213805.1）的OLR1基因編碼區序列進行同源性比對；利用ClustalW 進行氨基酸比對。

2 結果

2.1OLR1基因在3T3-L1 細胞分化過程中的表達規律如圖1 所示，隨著3T3-L1 細胞的分化，OLR1基因的表達量逐漸升高，其中分化6 d 細胞中的表達量高于未分化細胞（P＜0.01）。

圖1 OLR1 基因在3T3-L1 分化不同階段的表達量

2.2OLR1基因過表達載體的鑒定 過表達載體測序結果與小鼠OLR1基因（登錄號：ΝM_138648.2）序列完全一致，表明擴增正確；測序正確的陽性克隆菌經擴大培養、去內毒素提取質粒，測定質粒濃度為1 206 ng/μL，OD260/280為1.92，可用于后續實驗。質粒經EcoRΙ 和XhoΙ 雙酶切鑒定，片段大小與預期結果一致（圖2）。

圖2 OLR1 基因過表達載體EcoR Ι 和Xho Ι 酶切圖

2.3 生物信息學分析

2.3.1 小鼠OLR1 蛋白理化特征分析 小鼠OLR1基因編碼區全長1 092 bp，編碼363 個氨基酸，蛋白分子量為41.64 ku，理論等電點為7.55，不穩定系數為45.81，屬于不穩定蛋白，氨基酸組成見表2。

表2 小鼠OLR1 蛋白的氨基酸組成

2.3.2 蛋白二級結構預測 小鼠OLR1 蛋白二級結構預測表明，α-螺旋（Alpha helix）、延伸鏈（Extended strand）、β-轉角（Beta turn）和無規則卷曲（Random coil）分別占57.85%、13.77%、4.41%和23.97%（圖3）。

圖3 小鼠OLR1 蛋白二級結構預測

2.3.3 蛋白保守結構域預測 通過ΝCBΙ 中的Conserved Domains 對小鼠OLR1 蛋白保守結構域分析發現，該蛋白包含Smc（Chromosome segregation ATPase）結構域，位于第51～228 氨基酸處，以及C 型凝集素樣CLECT（C-type lectin-like）結構域，位于第235～356 氨基酸處，結果見圖4。

圖4 小鼠OLR1 蛋白保守結構域

2.3.4 同源性分析 同源比對結果顯示小鼠OLR1基因的編碼區序列與大鼠、豬、牛、綿羊和人的同源性分別為83.4%、49.8%、26.8%、23.4%和30.8%（圖5）。

圖5 6 個不同物種OLR1 基因編碼區序列的同源性分析

利用ClustalW 將小鼠OLR1基因編碼氨基酸序列與大鼠（Rattus norvegicus,ΝP_579840.2）、豬（Sus scrofa，ΝP_998970.1）、人（Homo sapiens，ΝP_002534.1）、牛（Bos taurus,ΝP_776557.1）和綿羊（Ovis aries，XP_012030794.2）OLR1基因編碼氨基酸序列進行比對，結果表明兩端序列相對比較保守（圖6）。

圖6 OLR1 氨基酸序列的同源性比對分析

3 討論

早期研究表明，OLR1基因參與人類心腦血管和脂蛋白代謝等相關的疾病[18-19]，因此備受關注。近幾年來有研究發現OLR1基因與豬的脂肪沉積、牛的肉質和乳脂率等性狀存在一定的相關性，可以作為影響家畜重要經濟性狀的候選基因[14]。本課題組前期對OLR1基因在不同豬種中的組織表達譜進行了研究，發現在脂肪組織中表達量較高，并且在梅山豬（肥胖型）中的表達量高于大白豬（瘦肉型），說明該基因與脂肪沉積有一定的關系[10]。然而，其在脂肪沉積過程中的表達規律及作用機制尚不清楚。

動物的脂肪沉積主要是脂肪細胞數量增加、體積增大以及脂滴聚集的過程[20]。對于動物脂肪細胞分化及調控機制的研究多采用的細胞模型為前脂肪細胞。前脂肪細胞是一類具有增殖和脂肪細胞定向分化能力的特異化前體細胞[21]。本研究采用小鼠的前體脂肪細胞系3T3-L1，該細胞系可以連續傳代，并且在適當條件下可以誘導分化成脂肪細胞，其生物學性能和形態都與體內脂肪細胞相似，是研究動物脂肪形成的理想模型[22]。研究結果顯示，隨著細胞的分化，基因表達量極顯著升高，說明OLR1基因對前脂肪細胞的成脂分化具有促進作用。

對小鼠OLR1基因分子生物學特征進行分析，發現OLR1 蛋白存在2 個功能結構域，分別為Smc 結構域和CLECT 結構域。Smc 家族與細胞周期、細胞分裂等功能相關[23]，推測OLR1基因可能通過該區域影響前脂肪細胞的周期，進而影響前脂肪細胞的增殖和凋亡。CLECT 結構域在不同物種中高度保守，它是OLR1 配體識別的區域，對配體的結合發揮著重要作用[24]，推測OLR1基因可能通過該區域識別脂肪沉積相關的配體，進而影響脂肪代謝。

4 結論

本實驗揭示了OLR1基因在小鼠前脂肪細胞分化過程中的表達規律，發現隨著細胞分化程度增加，OLR1基因表達量逐漸升高，說明該基因可以作為影響脂肪發育的候選基因。本實驗成功構建了小鼠OLR1基因過表達載體，可以轉染小鼠的前脂肪細胞，為研究基因在脂肪細胞增殖、分化和凋亡中的作用奠定基礎。