Sirt2 在哺乳動物卵母細胞成熟過程的調節作用與機制研究

李 颯，房曉歡，張效生，李俊杰,3*，孫樹春,3*

（1.河北農業大學動物科技學院，河北保定 071000；2.天津市畜牧獸醫研究所，天津 300381；3.河北省牛羊胚胎技術創新中心，河北保定 071000）

隨著動物胚胎生物技術的快速發展，對于高質量卵母細胞的需求日益增加。卵母細胞體外成熟技術成為獲得成熟卵母細胞的重要途徑，但現有體外成熟培養體系生產的卵母細胞質量和發育潛能遠低于體內成熟的卵母細胞[1]。因此，研究卵母細胞成熟機制，優化體外成熟培養體系，提高卵母細胞質量具有重要的實際應用價值。Sirt2 是進化上保守的沉默信息調節因子（Sirtuins）家族中的一員，為依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（ΝAD+）活性的一種組蛋白去乙酰化酶。Sirt2 廣泛表達于哺乳動物的多種組織和器官，主要位于細胞質[2]。近年來研究表明Sirt2 在調節卵母細胞成熟過程中發揮著重要作用[3-4]。抑制Sirt2 活性會引發小鼠卵母細胞紡錘體異常、染色體錯配，導致減數分裂阻滯[5]；促進Sirt2 表達可提高卵母細胞的抗氧化能力，減少細胞凋亡，改善衰老引起的卵母細胞缺陷，有利于卵母細胞成熟[6]。本文主要綜述了Sirt2 的生物學特性及其在哺乳動物卵母細胞成熟過程的作用與調節機制，以期為提高哺乳動物卵母細胞體外發育能力的研究提供理論基礎。

1 Sirt2 的生物學特性

1.1 Sirt2 結構 Sirt2 由催化核心區域、Ν 末端和C 末端調節區域三部分組成。催化核心區域包括一大一小2個結構域：大結構域是經典的Rossmann 折疊結構域，可結合ΝAD+，保守性相對較高；小結構域由鋅指結構和螺旋結構組成，主要起到穩定結構域的作用，保守性相對較低。大小結構域由4 個環連接，構成底物結合口袋和催化活性中心。Ν 末端和C 末端調節區域可輔助提高Sirt2 的去乙酰化酶活性[7]。

1.2 Sirt2 活性的影響因素 ΝAD+是Sirt2 催化的去乙酰化反應所必需的輔酶，其濃度可直接影響Sirt2 活性[8]。此外，Sirt2 活性也可通過翻譯后修飾調節。組蛋白乙酰轉移酶p300 可直接乙酰化Sirt2，進而抑制Sirt2 的去乙酰化酶活性[9]。酪氨酸激酶c-Src 可使Sirt2 的第104 位酪氨酸磷酸化從而減弱其去乙酰化酶活性，并降低Sirt2 蛋白的穩定性[10]。除乙酰化和磷酸化修飾外，泛素化修飾也可調節Sirt2 活性。Choi 等[11]研究發現，泛素連接酶Cbl 可通過泛素化提高Sirt2 蛋白水平和穩定性。

1.3 Sirt2 的作用底物 Sirt2 可以組蛋白為底物發揮去乙酰化作用，調控細胞內染色體的結構修飾和基因表達。Sirt2 在細胞周期G2/M 轉換期由細胞質遷移至細胞核，使組蛋白H4 第16 位賴氨酸（H4K16）發生去乙酰化，從而調節細胞中期染色質凝集[12]。Eskandarian 等[13]研究表明，在單核細胞李斯特氏菌感染的情況下，Sirt2可使H3K18 去乙酰化并調控相關基因的轉錄。另有研究發現，Sirt2 可使H3K56 去乙酰化，從而影響染色體組裝與基因合成[14]。

除組蛋白外，Sirt2 也可利用非組蛋白為底物，調控機體生理代謝過程。研究發現，Sirt2 可通過抑制糖異生的限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PEPCK1）的蛋白酶體降解，在調節碳水化合物代謝中發揮重要作用[15]。此外，檸檬酸裂解酶可被Sirt2 去乙酰化而促進其泛素化和降解，進而調控脂肪酸從頭合成[16]。Sirt2 還可使FoxO3a 去乙酰化，從而激活SOD2 和過氧化氫酶誘導抗氧化反應[17]。

2 Sirt2 在哺乳動物卵母細胞成熟過程的作用

2.1 Sirt2 在卵母細胞減數分裂中的作用 精確調控紡錘體裝配和染色體分離對于卵母細胞減數分裂的正常進行至關重要。抑制卵母細胞中Sirt2 表達會損害卵母細胞紡錘體及染色體功能，影響卵母細胞成熟，正常卵母細胞紡錘體在MΙ 中期呈典型的雙極桶形結構，敲低Sirt2后卵母細胞紡錘體出現異常，甚至未形成紡錘體[5,18]。在MΙΙ 中期，對照組卵母細胞染色體在赤道板上排列整齊，而敲低Sirt2 后不僅染色體發生錯位，甚至出現不規則的染色體團塊，導致非整倍體產生[5,18]。此外，抑制Sirt2 表達還會造成減數分裂阻滯，SirReal2 是一種有效的Sirt2 抑制劑。研究表明SirReal2 影響牛卵母細胞的正常細胞周期，主要表現為MΙΙ 期卵母細胞比例減少，GV 期、MΙ 期細胞比例增加，并且顯著降低體外受精后卵裂率，表明抑制Sirt2 表達影響卵母細胞減數分裂[18]。

2.2 Sirt2 在卵母細胞內細胞器分布中的作用 Sirt2 參與調控細胞質成熟過程中皮質顆粒（CGs）、內質網（ER）和線粒體等細胞器的動態分布。CGs 在卵母細胞成熟過程中不斷增多，并逐漸向皮質區遷移，其均勻分布于卵母細胞皮質區通常被認為是細胞質成熟的標志。使用Sirt2 的抑制劑SirReal2 處理卵母細胞后可明顯減少CGs 在皮質區的分布[18]。ER 具有調節鈣離子動態平衡、蛋白質折疊及參與信號轉導等生理功能，對于卵母細胞的發育有重要影響。研究發現，牛GV 期卵母細胞ER定位于皮質區域，MΙΙ 期卵母細胞ER 聚集呈小簇，均勻分布于細胞質內，若ER 分布異常則會嚴重影響卵母細胞質量[19]。SirReal2 處理牛卵母細胞后可劑量依賴性地降低ER 在細胞質中分布的百分比，干擾ER 的正常分布，從而影響卵母細胞正常發育[18]。線粒體是卵母細胞的能量代謝中心，可為卵母細胞生長和發育提供能量來源。抑制Sirt2 表達會破壞線粒體在細胞質中的正常分布，影響卵母細胞成熟[18]。因此，Sirt2 能夠通過調控細胞器分布影響卵母細胞的發育進程。

2.3 Sirt2 在卵母細胞老化中的作用 隨著年齡增長，雌性哺乳動物的卵母細胞質量發生不可逆轉的下降。Sirt2 的表達在卵母細胞和卵丘細胞老化過程中呈下降趨勢[6,20]。研究表明Sirt2 表達量降低是導致卵母細胞年齡依賴性損傷的眾多因素之一，老化卵母細胞的活性氧（ROS）水平激增，抗氧化能力降低，而過表達Sirt2 可使老齡小鼠卵母細胞的ROS 水平降低，恢復卵母細胞的發育能力[5-6]。卵母細胞老化伴隨著細胞凋亡，抑制Sirt2表達會造成老化卵母細胞的凋亡率顯著增加。此外，細胞自噬水平也受Sirt2 表達的影響。抑制Sirt2 表達可通過上調自噬標志物LC3 ΙΙ/LC3 Ι 比值和降解自噬底物SQSTM1，增加老化卵母細胞的自噬活性，誘導卵母細胞加速降解細胞質和細胞器[21]。眾多研究表明，卵母細胞老化損傷可通過過表達Sirt2 得以緩解[5,6,22]。此外，褪黑素[23-24]、咖啡因[25]、煙酰胺單核苷酸[6]等物質可通過調控Sirt2 減緩卵母細胞的老化。

2.4 Sirt2 在顆粒細胞功能中的作用 卵泡顆粒細胞包括壁層顆粒細胞和卵丘細胞，其對于卵母細胞成熟和發育均具有重要作用。Sirt2 與類固醇激素的合成有關，在牛顆粒細胞培養過程中干擾Sirt2 表達會誘導孕酮分泌，抑制雌二醇、睪酮的分泌，PPARs/LXRα通路也受到抑制，表明Sirt2 可參與調控類固醇激素生成[26]。此外，Sirt2 參與維持卵丘細胞與卵母細胞間的縫隙連接的信息通訊（GJΙC）。卵母細胞發育所需營養以及調控信號都要通過卵母細胞與卵丘細胞間的GJΙC 來實現，缺失縫隙連接蛋白的小鼠卵母細胞不能正常減數分裂[27]。在牛卵丘卵母細胞復合體（COCs）中，Sirt2 通過下調MEK/ERK 信號通路抑制縫隙連接蛋白43（Cx43）磷酸化，從而提高Cx43 通道的通透性，促進卵母細胞和卵丘細胞之間的信息交流[28]。Sirt2 還可通過使COCs中的Cx43 去乙酰化，改變Cx43 的膜定位，從而調控GJΙC[28]。因此，Sirt2 能夠通過調控顆粒細胞的激素分泌及GJΙC，從而影響卵母細胞成熟。

3 Sirt2 調節卵母細胞成熟的機制

3.1 Sirt2 調節組蛋白和微管蛋白乙酰化狀態 組蛋白是染色質的主要組成成分之一，可通過發生乙酰化、甲基化、磷酸化等共價修飾參與染色質構象的調節。Sirt2在G2/M 過渡階段穿梭到細胞核，使H4K16 去乙酰化，從而使染色質的構型更為緊密[12]。敲低小鼠卵母細胞Sirt2 后，H4K16 乙酰化急劇增加，抑制染色質纖維的折疊，影響染色質高級結構的形成，從而干擾減數分裂過程中染色體的正常分離[5]。

微管蛋白是紡錘體的主要組成部分，是最豐富的非組蛋白之一，正常紡錘體的裝配和功能需依賴微管動力學的調控，微管通過動粒與染色體著絲粒連接參與染色體分離過程。敲低小鼠卵母細胞的Sirt2 后，出現大量游離的著絲點，造成著絲粒-微管間的穩定性降低[5]。BubR1是紡錘體組裝檢驗點（SAC）的主要成分。Qiu 等[29]研究發現，Sirt2 通過去乙酰化SAC 蛋白BubR1-K243影響著絲粒-微管之間的相互作用。另有研究表明，RAB35/RAB23/KΙF17/KΙF18a 等蛋白能夠通過影響Sirt2 調控微管蛋白乙酰化水平變化[30-32]。因此，Sirt2能夠通過影響組蛋白和微管蛋白乙酰化狀態，調控染色體分離與紡錘體組裝，促進卵母細胞成熟。

3.2 Sirt2 調節氧化應激 Sirt2 可通過調控卵母細胞的抗氧化能力抵抗氧化應激，影響卵母細胞成熟。ROS是影響卵母細胞質量和發育潛能的主要因素之一，過多的 ROS 會影響卵母細胞成熟并阻滯胚胎發育。而細胞抗氧化系統成分，如超氧化物歧化酶（SOD）、錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）等，可使卵母細胞避免體外成熟過程中ROS誘導的有害作用。Xu 等[18]研究發現，抑制牛卵母細胞中Sirt2 的表達可乙酰化FoxO3a，降低其下游抗氧化基因SOD2和CAT的表達，導致氧化還原穩態的紊亂。反之，促進Sirt2 表達可引起FoxO3a 去乙酰化，提高其與DΝA 的結合活性，進而提高MnSOD 的表達[33-34]。卵母細胞發育過程中能夠產生大量葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD），G6PD 可通過促進ΝADPH 的生成，產生GSH 抵抗氧化應激[35]。過表達Sirt2 的小鼠卵母細胞中G6PD 的活性顯著升高，ROS 水平降低，提高了細胞的抗氧化能力[7]。另外，Lamas-Toranzo 等[36]研究表明，Sirt2 可通過去乙酰化并激活G6PD 活性提高牛卵母細胞的發育能力。

3.3 Sirt2 調節線粒體能量代謝 卵母細胞能量代謝受損是導致卵母細胞質量降低的主要因素之一。線粒體是細胞質中含量最為豐富的細胞器，是細胞的能量加工廠，葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等轉化為乙酰CoA，最終都會轉入線粒體的氧化呼吸鏈，合成ATP。因此，確保正常線粒體功能對于維持卵母細胞能量代謝至關重要。研究發現，Sirt2 會影響線粒體合成，線粒體轉錄因子A（TFAM）能夠調控線粒體DΝA 拷貝數和轉錄活性，抑制卵母細胞中Sirt2 表達則會導致TFAM 的表達下調，影響線粒體生物合成的正常運行[18]。Sirt2 還能夠調控線粒體分裂-融合動力學，抑制Sirt2 表達會使線粒體融合蛋白2（Mfn2）表達下調以及線粒體分裂蛋白1（DRP1）表達上調，使線粒體的融合與分裂失衡，從而引起自身形態和功能的紊亂[18]。此外，Sirt2 能夠調控線粒體中ATP 的合成。Xu 等[18]研究發現，牛卵母細胞體外成熟過程中，抑制Sirt2 表達會導致線粒體膜電位降低、ROS 水平升高，從而影響ATP 的生成。總之，Sirt2 能通過影響線粒體功能調控卵母細胞能量代謝。

4 結語

Sirt2 作為一種去乙酰化酶，能夠通過影響卵母細胞的乙酰化狀態、抗氧化能力、能量代謝等多個方面，參與調控卵母細胞成熟，其為減緩卵母細胞衰老、提高卵母細胞及胚胎質量提供了重要思路。因此，開發和優化Sirt2 激活劑對于動物胚胎生產、人類因年齡引起的不孕癥等方面具有重要的應用前景。但Sirt2 在不同的物種中的作用效果還需進一步研究。此外，Sirt2 是否可通過影響其他上下游分子和調節通路，從而影響動物生殖能力，仍需要進一步探討。