不同水平酪氨酸對體外培養(yǎng)綿羊下丘腦神經(jīng)細胞分泌GnRH 的影響

南 穎，翟曼君，朱夢婷，王明遠，邵焱焱，趙宗勝

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000）

綿羊季節(jié)性發(fā)情受下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）的調(diào)控[1]。血液中的酪氨酸（Tyrosinase，Tyr）通過酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變成褪黑激素，促使下丘腦釋放在綿羊發(fā)情中具有始作用的促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-Releasing Hormone，GnRH），作用于HPG 調(diào)節(jié)促性腺激素的釋放進而影響綿羊發(fā)情[2-3]。

Tyr 通過動物覓食后分解進入機體參與體內(nèi)信息傳遞，涉及腦內(nèi)很多重要的生理功能，屬于腦內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，可調(diào)控多巴胺的合成。Yu 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中對GnRH 的釋放表現(xiàn)出雙重調(diào)節(jié)作用。Rǔse 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，補充Tyr 的青年母豬1 周左右出現(xiàn)發(fā)情，GnRH 分泌量明顯升高，配種后平均多產(chǎn)3.1 頭仔豬，表明Tyr 對動物發(fā)情有促進作用。許多學(xué)者認為Tyr 使大、小鼠卵巢孕酮的分泌量明顯增加，可促進和誘導(dǎo)排卵，并且Tyr 能促進大鼠黃體細胞凋亡從而調(diào)節(jié)動物發(fā)情[6-9]。林杉[10]認為，Tyr 通過調(diào)控多巴胺的合成作用于MMP14調(diào)控MEK1基因通過GnRH信號通路進而促進綿羊發(fā)情，但具體調(diào)控機制還不清楚。Tyr 對促進動物發(fā)情有明顯效果，但大部分研究都在常年發(fā)情動物上，其對季節(jié)性發(fā)情動物起作用的劑量還未證實。翟曼君[11]提到，在雌性胎綿羊下丘腦神經(jīng)細胞中 DRD1 通 過 Dopaminergic synapse 和 Calcium 信 號通路調(diào)控其下游基因 GnAQ 進而影響 GnRH 的表達。大量研究證明，機體合成Tyr 水平的波動變化與動物維持正常繁殖活動密切相關(guān)，Tyr 通過調(diào)控多巴胺的合成作用于HPG，對下丘腦GnRH 的釋放表現(xiàn)雙重調(diào)控作用，進而調(diào)節(jié)促性腺激素的釋放影響動物發(fā)情[12-14]。基于此，本研究針對Try 引起綿羊下丘腦神經(jīng)細胞分泌GnRH 的具體生理濃度進行研究，為營養(yǎng)誘導(dǎo)綿羊發(fā)情的內(nèi)分泌機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 14 周胎齡左右的雌性綿羊胎兒來自石河子牛羊定點屠宰場，DAPΙ（1 mg/mL）、L-Tyr（25g）購自索萊寶公司，Sheep GnRH Elisa Kits、Lipofectamine 2000、BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 試劑盒購自賽默飛公司，DMEM、胎牛血清、ΙV 型膠原酶、多聚賴氨酸、阿糖胞苷購自TaKaRa 公司，兔抗DRD1 一體、山羊抗兔Ιgg 二抗購自艾博抗公司，Anti-MAP2-cy3 購自上海信裕生物科技有限公司，引物均由上海生工完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞分離培養(yǎng)與鑒定 無菌條件下，打開14 周胎齡左右的雌性綿胎羊顱腔，摘除腦膜分離下丘腦，1%PBS 清洗干凈。組織剪碎為1 mm3用ΙV 型膠原酶消化3 min。細胞以每孔5×105個/cm2的密度接種于6 孔板中（培養(yǎng)皿用多聚賴氨酸預(yù)包被），48 h 后觀察細胞狀態(tài)，換液為神經(jīng)細胞培養(yǎng)基，隔天加入含阿糖胞苷10 μmol/L培養(yǎng)基，每次換液更換量為原體積的1/2。

用神經(jīng)細胞的特異性抗體Anti-MAP2-cy3 對培養(yǎng)10 d 的細胞進行免疫熒光鑒定。棄培養(yǎng)基PBS 清洗細胞后用4% 多聚甲醛固定20 min，1%PBS 清洗3 次，每次5 min；0.4% TritonX-100 于4℃作用30 min，2%山羊血清封閉30 min，棄去血清封閉液，1% PBS 清洗3 次，每次5 min；加一抗（Anti-MAP2，1:100）4 ℃孵育過夜后，吸出一抗換熒光二抗（Anti-Rabbit Ιgg，1:100）室溫避光孵育2 h 后棄液；加入300 μL DAPΙ稀釋液作用5 min，熒光倒置顯微鏡觀察熒光并拍照，統(tǒng)計。

1.2.2 Tyr 處理下丘腦神經(jīng)細胞 1 mol/L ΝaOH 溶液將Tyr 粉末溶解后置于4℃保存，待細胞爬滿培養(yǎng)皿的70%～80%時，無血清DMEM 饑餓培養(yǎng)12 h 后加0（對照組）、0.02、0.2、2 mmol/L Tyr 處理細胞，使用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)24 h 后收集細胞和培養(yǎng)液，每個處理3 個重復(fù)。

1.2.3 DRD1 蛋白表達水平檢測 細胞用超聲波裂解儀破碎后，3 000 r/min 離心10 min，收集各試驗組細胞裂解上清進行蛋白純化，按BCA 蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白濃度。各試驗組蛋白樣品取100 μg 于新離心管中，加入2×SDS 蛋白凝膠上樣液，PCR 98℃變性處理10 min 后，用10%分離膠進行SDS-PAGE 后，轉(zhuǎn)置硝酸纖維素膜上，用45 g/L 脫脂奶粉4℃搖床封閉過夜后用TBST 洗膜3 次，加入一抗（兔抗DRD1，1:300）37℃孵育1 h，用TBST 洗膜3 次，加入二抗（山羊抗兔Ιgg，1:1000）37℃孵育1 h，TBST 洗膜后滴加ECL顯色劑用熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行化學(xué)發(fā)光、照相，Odyssey CLX 近紅外雙色熒光成像系統(tǒng)拍照檢測發(fā)光值。

1.2.4 DRD1 蛋白、mRΝA 表達水平檢測 采用飽和酚-氯仿抽提法提取細胞DΝA，1%瓊脂糖電泳檢查提取細胞DΝA 的完整性，經(jīng)紫外分光光度計檢測純度。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中公布的序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物（表1），PCR 反應(yīng)體系為20 μL：上、下游引物各1 μL（1μmol/L）、模板cDΝA 2 μL、SYBR Green Ⅰ Master 10 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃、3 min；變性95℃、10 s，退火54℃、20 s，延伸65℃、5 s，40 個循環(huán)；延伸72℃、5 min；4℃保存。

表1 實時定量 PCR 引物

1.2.5 GnRH 激素檢測 采用綿羊GnRH 酶聯(lián)免疫標(biāo)記檢測試劑盒檢測各試驗組GnRH 的含量，具體操作參照試劑盒說明書[17]。

1.2.6 統(tǒng)計分析 用SPSS17.0 進行數(shù)據(jù)分析，2-△△CT計算相對表達量，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代下丘腦神經(jīng)細胞的培養(yǎng)與鑒定 獲得14 周胎齡左右的雌性綿羊胎兒（圖1-A），下丘腦位置見圖1-B。分離培養(yǎng)2 d 后觀察原代下丘腦神經(jīng)細胞生長緩慢，當(dāng)培養(yǎng)10 d 后細胞形態(tài)呈長梭型逐漸形成神經(jīng)細胞網(wǎng)絡(luò)，細胞狀態(tài)達到后續(xù)試驗要求（圖2-A，圖2-B）。

圖1 胎羊下丘腦位置

特異性抗體Anti-MAP2 對細胞進行免疫熒光鑒定，結(jié)果表明細胞的MAP2 染色均為陽性，MAP2 在胞質(zhì)中表達（圖2-D），DAPΙ 在細胞核中表達（圖2-C），兩者結(jié)合看如圖2-E，證實所培養(yǎng)細胞為神經(jīng)細胞，且純度達95%以上。

圖2 神經(jīng)元MAP-2 免疫熒光染色（×10）

2.2 Tyr 處理后檢測DRD1 蛋白、mRΝA 的表達 觀察細胞添加Tyr 24 h 后狀態(tài)，0.02 mmol/L 組與對照組無明顯差異，細胞形態(tài)良好（圖3-C）。0.2 mmol/L 組與對照組相比，細胞密度減少，細胞狀態(tài)較好（圖3-B）。2 mmol/L 組細胞狀態(tài)與對照組相比，細胞密度減少，出現(xiàn)細胞死亡現(xiàn)象，形態(tài)皺縮，貼壁狀態(tài)不佳（圖3-A）。說明添加0.2 mmol/L Tyr 對下丘腦細胞生長有促進作用，添加2 mmol/L Tyr 時不利于下丘腦細胞生長。

圖3 添加Tyr 24 h 后細胞生長狀態(tài)

檢測添加Tyr 24 h 后DRD1 蛋白水平，2 mmol/L Tyr 組和0.02 mmol/L Tyr 組細胞DRD1 的蛋白水平與空白組無明顯差別，0.2 mmol/L 組DRD1 的蛋白水平上升（圖4）。

圖4 DRD1 蛋白水平檢測結(jié)果

如圖5 所示，添加Tyr 24 h 后，2 mmol/L 組DRD1基因表達量與對照組差異不顯著；0.2 mmol/L 組DRD1基因表達與對照組差異極顯著，并且顯著高于其他3 組；0.02 mmol/L 組DRD1基因表達與對照組和2 mmol/L 組差異顯著。

圖5 DRD1 基因 mRΝA 表達量

結(jié)果表明，一定時間內(nèi)DRD1 蛋白、mRΝA 的表達會隨著Tyr 濃度的增加而升高，但Tyr 濃度過高對DRD1 蛋白、mRΝA 的表達影響微小。

2.3 Tyr 處理后檢測GnRH 分泌水平 如圖6 所示，添加Tyr 24 h 后，0.2 mmol/L 組GnRH 分泌量最高，2 mmol/L組GnRH 分泌量最低，各組之間均表現(xiàn)為差異顯著，GnRH 的分泌隨Tyr 濃度的增加呈先升高后降低趨勢，表明添加適量濃度的Tyr 能夠促進GnRH 的分泌，但當(dāng)濃度過高時會抑制GnRH 的分泌。

圖6 GnRH 檢測結(jié)果

3 討論

3.1 Tyr 對綿羊季節(jié)性發(fā)情時GnRH 水平的影響 下丘腦分泌的GnRH 是影響綿羊發(fā)情的關(guān)鍵因素。葛聞博[15]發(fā)現(xiàn)，甘加藏羊發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期血漿中GnRH水平分別比發(fā)情間期提高1%、36%、11%。Fink等[16]以Tyr 處理家兔體外培養(yǎng)的垂體前葉細胞后促進了LH分泌，從而大程度地加強了GnRH 效應(yīng)。為驗證Tyr與季節(jié)性動物發(fā)情的關(guān)系，本研究給予綿羊下丘腦神經(jīng)細胞不同水平Tyr 處理，發(fā)現(xiàn)0.02、0.2 mmol/L組GnRH 分泌水平比對照組分別提高12%、29%，2 mmol/L組比對照組GnRH 分泌水平降低35%。添加Tyr 后下丘腦神經(jīng)細胞GnRH 水平呈先升高后降低的趨勢符合發(fā)情期生理現(xiàn)象，表明適量濃度Tyr 促進下丘腦GnRH 的分泌。

3.2 Tyr 對綿羊發(fā)情相關(guān)基因DRD1表達的影響 翟曼君[11]研究發(fā)現(xiàn)綿羊發(fā)情相關(guān)基因DRD1是Dopaminergic synapse通路中GnAQ 上游基因，過表達綿羊下丘腦神經(jīng)細胞中DRD1后，發(fā)現(xiàn)GnAQ基因表達下調(diào)，GnRH基因表達上調(diào)，放大了GnRH 效應(yīng)。梁慧慧[17]在綿羊下丘腦神經(jīng)細胞中發(fā)現(xiàn)，GΝAQ表達下調(diào)時可調(diào)節(jié)kisspeptin的表達，通過kisspeptin/GPR54 信號通路間接調(diào)控GnRH基因和GnRH 水平上調(diào)。本研究以不同水平Tyr 處理綿羊下丘腦神經(jīng)細胞，24 h 后發(fā)現(xiàn)添加0.2 mmol/L 組DRD1 蛋白、mRΝA 表達水平極顯著于對照組，并且顯著高于其他3 組。本研究認為適量濃度Tyr 能夠提高DRD1 蛋白、mRΝA 表達量，其可能通過調(diào)控基因GnAQ進而影響下丘腦中GnRH 水平，最終通過HPG 軸調(diào)節(jié)綿羊發(fā)情。

本研究證實，下丘腦中0.2 mmol/L Tyr 可高效調(diào)控多巴胺合成進而作用于DRD1基因加強GnRH 效應(yīng)，為誘導(dǎo)綿羊發(fā)情的內(nèi)分泌機制研究提供科學(xué)依據(jù)。