生物信息技術篩選雞空腸和盲腸的差異基因

樊慶燦

（宜春學院生命科學與資源環境學院，江西宜春 336000）

腸道具有轉運和消化食物、吸收營養、排泄廢物、維持生物體內環境穩定等功能，并在細胞和體液免疫、機體解毒和自愈等方面發揮重要作用[1]。雞（Gallus domesticus）腸道包括小腸和大腸。小腸分為十二指腸、空腸和回腸，是消化食物和吸收營養物質的主要場所。大腸是由一對盲腸和直腸組成，盲腸后腸壁有豐富的淋巴組織形成盲腸扁桃體。目前，雞腸道相關的分子研究雖然較多，但集中在腸道微生物方面[2-4]，空腸和盲腸組織的分子研究較少。Bertocchi 等[5]利用雞空腸和盲腸組織的轉錄組數據篩選腸道不同部位的差異表達基因，從分子水平探討空腸和盲腸新功能。本研究利用基因表達綜合數據庫（Gene Expressioni Omnibus，GEO）中的數據，研究雞空腸和盲腸的差異表達基因，討論空腸和盲腸對不同營養物質的消化吸收作用和分子機理。

1 材料方法

1.1 數據來源 本研究所用數據來自于美國國家生物技術信息中心基因表達綜合數據庫，編號為GSE124066（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi）。19 只體重均等的Ros308 公雞（42 d）屠宰后采集空腸和盲腸黏膜組織，利用GeneChip Chicken 1.0 ST Array（Affymetrix，Santa Clara，California，USA），測定空腸和盲腸各基因的表達量。

1.2 分析方法 將GSE124066 輸入到BART（http://igc1.salk.edu:3838/bart/）的相應數據框中，平臺類型為GPL19014，分組依據選擇組織，所用的數據類型選擇CEL 數據，數據上傳后，BART 會首先對原始數據中的轉錄本表達矩陣進行log2 轉換并做標準化。接下來做PCA 主成分分析對數據進行質控，矯正后用LΙMMA做差異分析。分析完成后下載標準基因表達量表、基因表達差異表和火山圖。在Excel 中將adj.P＜0.05 且|logFC|＞1 的轉錄本稱為差異表達轉錄本（Differentially Expressed Transcripts，DETs），對應的基因作為差異表達基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）。將logFC＞1 和logFC＜-1 的DEGs 分別導入STRΙΝG（https://string-db.org/cgi/input.pl? sessionΙd=ΝPdug dyy2MoP &input_page_show_search=on）、Cytoskype 3.6.0 的BΙΝGO 插件和DAVΙD 6.8（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）中，進行蛋白互作分析、生物過程富集分析和KEGG 分 析。把STRΙΝG 中combine score＞0.7的互作網絡數據導入Cytoskype 中繪制互作圖，利用cytoHubb 插件Betweenness 法篩選互作圖中的核心基因。

2 結果

2.1 差異表達結果 結果顯示在空腸中表達上調的DETs共677 個（logFC＜-1），對 應517 個可識別DEGs。在盲腸中表達上調的DETs 共660 個（logFC＞1），對應534 個可識別DEGs。其中差異倍數大于6 的DEGs 見表1，其中空腸上調的DEGs 共10 個，載脂蛋白B（Apolipoprotein B，APOB）為差異倍數最大的DEG，此外包括4 個轉運蛋白基因和5 個代謝相關酶。4 個轉運蛋白基因為視黃醇結合蛋白2（Retinol Binding Protein 2，RBP2）、脂溶性載體家族6A19（Solute Carrier Family 6 Member 19，SLC6A19）、脂溶性載體家族15A1（Solute Carrier Family 15 Member 1，SLC15A1）和脂溶性載體家族7A9（Solute Carrier Family 7 Member 9，SLC7A9）。5 個代謝相關酶為谷氨酸谷氨氨肽酶（Glutamyl Aminopeptidase，EΝPEP）、甲基多巴α亞基（Meprin A Subunit Alpha，MEP1A）、蔗糖酶異麥芽糖酶復合物（Sucrase-Ιsomaltase，SΙ）、血管緊張素轉換酶2（Angiotensin Ι Converting Enzyme 2，ACE2）和麥芽糖酶葡糖淀粉酶（Maltase-Glucoamylase，MGAM）。盲腸中表達上調的DEGs 為2 個，胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine Beta-Synthase，CBS）為差異倍數最大的基因，其次為T 細胞分化相關蛋白（T Cell Differen tiation Protein，MAL）。

表1 表達差異倍數大于6 的DEGs

將空腸中517 個和盲腸中534 個DEGs 分別進行互作分析和核心基因篩選，圖1 為部分基因的互作網絡圖。其中空腸（圖1-a）DEGs 互作網絡中的5 個核心基因分別為APOB、載脂蛋白A1（Apolipoprotein A1，APOA1）、骨髓基質細胞抗原1（Bone Marrow Stromal Cell Antigen 1，BST1）、黑素轉鐵蛋白2（Recombinant Melanotransferrin2，MFΙ2）和RBP2，其中APOB和RBP2為差異倍數大于6 的DEGs。盲腸（圖1-b）DEGs 互作網絡中的核心基因為周期依賴蛋白激酶1（Cyclin Dependent Kinase 1，CDK1）、細胞分裂周期蛋白20（Cell Division Cycle 20，CDC20）、絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶1（Polo Like Kinase 1，PLK1）、正核分裂周期蛋白80（Νuclear Division Cycle 80，Νdc80）和微小染色體維持復合物5（Minichromosome Maintenance Complex Component 5，MCM5）。

圖1 空腸和盲腸的部分DEGs 互作圖

2.2 空腸和盲腸DEGs 聚類分析 對空腸和盲腸中表達上調的DEGs 進行生物過程的GO 分析，空腸和盲腸中最為顯著的10 個條目見表2。在空腸中表達上調的DEGs 主要聚集在脂、醚、酒精、小分子代謝和跨膜運輸，其中脂代謝條目為P值最小條目，聚集在此條目的DEGs 有23 個。此外，篩選出多條脂代謝相關條目。盲腸中表達上調的DEGs 主要聚集在機體發育和細胞周期相關的條目，其中多細胞有機發育是P值最小的條目，聚集在此條目的DEGs 有74 個。此外，篩選出多條機體發育相關的條目。

表2 空腸和盲腸DEGs 生物過程分析的部分結果（前10 項）

對空腸和盲腸中表達上調的DEGs 進行KEGG 分析，P＜0.01 的信號通路見圖2。在空腸中表達上調的DEGs 參與PPAR 信號通路（03320）、代謝通路（01100）、過氧化物體（04146）、脂肪酸代謝（01212）和脂肪酸降解（00071）信號通路，其中PPAR 信號通路是P值最小的信號通路，有18 個DEGs 參與該通路。在盲腸中表達上調的DEGs 參與細胞周期（04110）、黏附斑信號通路（04510）、ECM-受體互作通路（04512）、硫代謝（00920）、抗生素合成（01130）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（00270）信號通路，其中細胞周期是P值最小的信號通路，共有14 個DEGs 參與該通路。

圖2 空腸和盲腸DEGs 信號通路分析部分結果

3 討論

本研究篩選出空腸中的表達上調的DEGs，從分子水平證實了空腸的生理功能。差異基因中MGAM編碼的酶蛋白可作為α-淀粉酶活性降低時的替代酶，SΙ編碼蛋白則在碳水化合物消化的最后階段起著重要作用，聚類分析也篩選出酒精和小分子代謝條目。差異基因和聚類分析結果說明經過胃和十二指腸后，空腸是碳水化合物的消化末端，具有預防前端碳水化合物消化不完全的備用酶。聚類分析篩選的10 個條目中，7 個與脂代謝有關。KEGG 分析中，過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）和過氧化物酶體信號通路參與調節脂類、葡萄糖代謝和炎癥反應[6-7]，其余通路也均與脂肪酸代謝有關，說明空腸中脂肪酸的消化和代謝相對比較活躍。在差異倍數較大的基因中，有氨基酸、脂類和維生素類轉運蛋白，5 個核心基因中有4 個參與營養物質轉運，說明空腸對各類營養物質都具有更強的吸收作用。聚類分析中的跨膜轉運條目證明了空腸的吸收功能。綜上所述，與盲腸相比，雞的空腸中有少量的碳水化合物消化和比較旺盛的脂類消化，并對氨基酸、脂肪和維生素等具有更強的吸收作用。

雞盲腸的表達上調的DEGs 主要聚集在機體發育和細胞周期，5 個核心基因均與細胞周期有關。這可能與雞盲腸扁桃體的功能密切相關。盲腸扁桃體是禽類最大的腸相關性淋巴組織，由彌散性和密集型淋巴組織組成[8]，含T 淋巴細胞和B 淋巴細胞，對腸道病原菌具有局部免疫作用[9-10]。扁桃體相關細胞活動比較活躍，細胞周期基因表達量則相應上調。KEGG 分析中，黏附斑和ECM-受體互作通路參與細胞信號傳導，具有調節細胞分化和增殖[11-14]等生理作用，與細胞周期的調節密切相關。硫代謝、半胱氨酸和組氨酸代謝在腸道相關的研究中報道較少。半胱氨酸和組氨酸是雞體內的含硫氨基酸。生物體內的硫有轉移基團的作用[15]。含硫氨基酸具有抗氧化和清理腸道內自由基等作用，還是蛋白質生物活性的關鍵氨基酸[16-17]。盲腸內硫代謝和含硫氨基酸相關基因的高表達可能與抗體生成、抗生素合成和腸道自由基的清除有關。此外，由于盲腸中存在豐富的腸道微生物，抗生素的合成也是必不可少。傳統觀點認為，盲腸主要吸收粗纖維分解的脂肪酸和細菌合成的維生素，本研究中并未發現相關DEGs。可能是與空腸相比，盲腸中的脂肪酸和維生素吸收只是少量，盲腸中相關基因的表達量遠遠低于空腸。

在差異倍數較大的DEGs 中，空腸中高表達的ACE2和盲腸中高表達的CBS具有廣泛的生物學功能。ACE2編碼蛋白的羧肽酶結構域不僅能有效切割血管緊張素（Ang）ΙΙ 的C 末端苯丙氨酸，產生血管擴張劑Ang 1-7，還通過切割Ang Ι 的C 末端亮氨酸生成Ang 1-9，并進一步加工為Ang 1-7[18-19]，抵消血管緊張素的作用，舒張血管，增加血流量。空腸中ACE2的高表達能夠擴張消化道血管系統，促進營養物質吸收。此外，ACE2能協助將中性氨基酸轉運蛋白SL6A19 轉運至腸上皮細胞的質膜，促進腸道中性氨基酸的運輸[19-20]。這與空腸功能也是相符的。CBS催化同型半胱氨酸（Hcy）與絲氨酸的縮合形成胱硫醚[16]，這是轉硫途徑中的起始步驟和限速步驟[21-22]。CBS缺乏會導致同型半胱氨酸尿癥[23]。胱硫醚隨后被胱硫醚γ-裂解酶（CTH）裂解形成半胱氨酸，后者為谷胱甘肽的前體[17]。此外，CBS還參與了內源性硫化氫（H2S）生成[24]。CBS通過控制Hcy 和H2S 代謝發揮多種生物學功能，包括氧化還原穩態和蛋白質修飾等[17,22]。本研究發現盲腸中高表達CBS可能會參與抗體等蛋白的修飾，并在維持腸道的氧化還原方面發揮重要作用。

4 結論

本研究篩選了空腸和盲腸中的差異表達基因并進行生物信息學分析，從分子角度探討空腸和盲腸的生理功能，發現空腸中脂肪消化比較旺盛，碳水化合物的消化相對較弱，且蛋白質、維生素和脂肪酸等營養物質的吸收作用較強；盲腸與腸道的局部免疫有關，可維持腸道內環境的穩定。