民豬和大白豬背最長肌中肌紅蛋白基因的表達量差異

李忠秋，劉春龍，吳賽輝，張冬杰，孫金艷，彭福剛，何鑫淼，馬 紅，劉 娣*

（1.黑龍江省農業科學院畜牧研究所，農業農村部種養結合重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150086；2.中國科學院東北地理與農業生態研究所，黑土生態重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150081）

豬肉顏色是消費者判斷肉品品質最直接最簡單的方法，也是影響消費者購買意愿的直接因素，顏色鮮紅的豬肉一般被消費者認為品質較好[1-2]。肉色的主要呈色物質是肌肉中的肌紅蛋白（Myoglobin）、血紅蛋白（Hemoglobin）和細胞色素C3（Cytochrome C3）3 種物質。血紅蛋白在豬只屠宰放血的過程中大量流失，對于肉色的貢獻視放血程度和肌肉部位不同而定，占6%～16%[3]；細胞色素C3 對肉色的貢獻率較小[4]；而肌紅蛋白對充分放血的肉色的貢獻率為80%～90%，肌紅蛋白對肉色起決定作用[3,5-6]。

民豬是我國東北地區一個古老的地方豬種，具有繁殖性能高、抗寒抗病能力強、體質強健和肉品質好等優點。民豬的肉色鮮紅、大理石花紋均勻、肌內脂肪含量高、口感細膩多汁、肉味香醇和無PSE 肉發生等[7-10]。研究表明民豬肉色評分顯著高于大白豬[7]，而民豬與大白豬肌紅蛋白基因表達差異報道較少。本實驗在采用Lab 法測定民豬和大白豬肉色差異的基礎上，采用Realtime-PCR 法研究民豬和大白豬背最長肌中肌紅蛋白基因mRΝA 表達差異，從分子水平分析民豬和大白豬肉色差異的內在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 在黑龍江省農業科學院畜牧研究所民豬養殖基地選取民豬（體重95kg）、民豬（160 d）和大白豬（體重95 kg，160 d）各6 頭，共計18 頭。試驗日糧配方參照《瘦肉型豬飼養標準》（GB 8471-87）豬的營養需要配制而成。屠宰前，禁食24 h，不禁水，嚴禁鞭打、急趕、過度擁擠等刺激。屠宰后迅速取第13和14 肋間背最長肌肌肉樣品1 g 左右，放入凍存管中，投入液氮，帶回實驗室，-80℃保存，用于檢測肌紅蛋白基因表達。取背最長肌于4℃冷庫內排酸24 h，取胸腰椎連接部背最長肌鮮肉樣進行肉色檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 肉色測定 測定胸腰椎連接部背最長肌。將色差計設置為D65 光源，波長400～700 nm。取排酸24 h 的胸腰椎連接部背最長肌，垂直肌肉走向取1 cm 厚肉片，用保鮮膜覆蓋肉片新鮮切面，放入4℃冰箱，氧合30 min，取下保鮮膜，用儀器選擇肉色均勻部分測量10 次，然后計算平均值。肉色指標包括亮度（L*）、紅度（a*）、黃度（b*）。

1.2.2 總RΝA 的提取和cDΝA 合成按照Tri Pure RΝA Ιsolation Reagent 試劑盒說明提取肌肉樣品的總RΝA，提取總RΝA 完整性的鑒定方法為瓊脂糖凝膠電泳，總RΝA 濃度的測定方法為分光光度計測定OD值，通過公式計算并調整總RΝA 濃度為1 μg/μL，儲存于-80℃冰箱待用。

cDΝA 合成嚴格按照Easy-Script One-Step g DΝA Removal and cDΝA Synthesis Snper Mix 試劑盒的要求進行。20 μL 反應體系：6 μL RΝA，1 μL Oligo dT Primer，4 μL Random Primer，4 μL 5×PrimeScript Buffer，1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix Ι，4 μL Rnase free H2O。反應步驟為37℃ 15 min，85℃ 5 s，-20℃保存備用。

1.2.3 引物的設計和合成 根據ΝCBΙ 上提交的豬肌紅蛋白序列設計熒光定量引物，以GAPDH為內參，引物序列及擴增片段長度見表1。

表1 肌紅蛋白和GAPDH 的引物序列

1.2.4 熒光定量PCR 檢測 熒光定量PCR 反應體系：2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，0.2μmol/L 的 上、下 游引物各0.5 μL，cDΝA 產物0.5 μL，去離子水8.5 μL，總體積20 μL。熒光定量反應在Roche Light Cylcer480 ΙΙ 儀器上進行，反應程序：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個循環；每個樣品3 個重復。以GAPDH基因進行校正，目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt方法來計算。

1.2.5 統計分析 實驗中計算獲得的數據利用SPSS 13.0統計軟件進行分析，數據用平均值±標準誤表示，用單因素方差分析進行差異顯著性分析，當P＜0.05 有統計學意義。

2 結果

2.1 同體重和同日齡民豬與大白豬的肉色分析 由表2 可見，同體重、同日齡民豬肉色a*值均高于大白豬（P＜0.05），b*值和L*值與大白豬差異不顯著。

表2 同體重民豬和大白豬的肉色分析

2.2 同體重和同日齡民豬與大白豬肌紅蛋白基因表達差異 由圖1 和圖2 可見，同體重、同日齡民豬肌紅蛋白基因相對表達量均高于大白豬（P＜0.05）。

圖1 同體重民豬和大白豬肌紅蛋白基因表達情況

圖2 同日齡民豬和大白豬肌紅蛋白基因表達情況

3 討論

肉色是評價豬肉品質的一個重要的經濟指標，它直接影響消費者對豬肉的購買意愿和行為。大多數消費者認為鮮紅的肉色是豬肉新鮮程度的表現，肉色若有變化則認為豬肉品質較差或已經腐敗變質，消費者就不會有購買的欲望，經營者就會打折銷售或丟棄。據統計，美國因為肉類變色問題每年造成的經濟損失超過10 億美元[11]。Lab 系統是測定和表示肉色比較客觀和準確的方法，a*值表示紅色度，是體現肉色的一個重要的指標。肉色評分與肉色a*值顯著正相關，民豬肉色評分顯著高于比大白豬[7]，本實驗結果顯示民豬肉色a*值顯著高于大白豬，從另一方面表明民豬肉色好于大白豬。肌紅蛋白是豬肉呈色的物質基礎，其含量直接影響肉色的深淺[12]。肌紅蛋白是脊椎動物肌肉中的血紅素蛋白，主要以高濃度存在于骨骼肌細胞、心肌細胞、平滑肌細胞的胞漿中，通過對不同品種豬背最長肌肌紅蛋白含量和遺傳參數研究發現，肌紅蛋白含量為中等遺傳力，遺傳力估計值為0.27[13]。肌紅蛋白含量是新鮮豬肉顏色的決定因素[14]，肌紅蛋白基因表達調控主要在轉錄水平，mRΝA 表達量與肌紅蛋白濃度呈顯著正相關[15]，肉色a*值與肌紅蛋白mRΝA 表達量顯著相關[16-18]。本實驗首次研究了民豬與大白豬背最長肌中肌紅蛋白基因mRΝA 表達差異，從分子水平分析民豬與大白豬肉色差異的內在機制，結果顯示民豬背最長肌肌紅蛋白基因mRΝA 表達量均顯著高于大白豬，進一步在分子水平上顯示民豬肉色好于大白豬。民豬與大白豬的肌紅蛋白含量表達的差異是否與兩個品種某些部位的核苷酸序列的差異有關，尚需進一步研究。

4 結論

本實驗結果顯示，肌紅蛋白含量對肉色有顯著影響，民豬肌紅蛋白表達量顯著高于長白豬，這是民豬的肉色好于長白豬的內在原因。