NRG1及其受體ErbB4在大鼠不同發(fā)育階段不同腦區(qū)表達(dá)及與抑郁認(rèn)知功能關(guān)系研究

彭小健，劉海洋，張紅星

(1.商洛市中心醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 商洛 726000；2.商洛市中心醫(yī)院CT室,陜西 商洛 726000；3.西北大學(xué)附屬西安高新醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科,陜西 西安 710075)

抑郁癥作為精神科常見疾病，患者常見情緒低落、興趣減退，嚴(yán)重者可出現(xiàn)自殺觀念和行為，極大的危害了人類健康，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān)[1-3]。近年來大量研究表明，抑郁患者常伴有一定程度的認(rèn)知功能損傷，學(xué)習(xí)、記憶能力、抽象思維、反應(yīng)速度等臨床表現(xiàn)，且隨著抑郁癥病程的進(jìn)展而加劇，嚴(yán)重影響患者的遠(yuǎn)期預(yù)后和生活質(zhì)量[4-5]。

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(Neuroregulin 1，NRG1)及其受體ErbB4作為抑郁癥的易感基因，在抑郁動物模型大腦組織中高表達(dá)[6-8]。Ada等[9]研究認(rèn)為，NRG1和ErbB4在維持神經(jīng)環(huán)路平衡、神經(jīng)元發(fā)育、突觸的發(fā)育及其功能維持、神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞等過程中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。動物研究表明，脆弱X綜合征(FXS)小鼠智力缺陷以及學(xué)習(xí)功能障礙可能與其ErbB4表達(dá)下調(diào)影響了小鼠大腦皮質(zhì)小清蛋白(PV)陽性中間神經(jīng)元數(shù)量減少有關(guān)，初步認(rèn)為ErbB4參與了FXS小鼠的發(fā)病過程[10]。但關(guān)于NRG1/ErbB4在不同發(fā)育階段、不同腦區(qū)抑郁大鼠中的變化目前研究仍較少。因此，本文探討了NRG1/ErbB4在不同發(fā)育階段抑郁大鼠不同腦區(qū)中的表達(dá)及其與認(rèn)知功能障礙的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠60只，體重(150±50)g，購自于北京維通利華有限責(zé)任公司，于實驗中心進(jìn)行繁殖，常規(guī)喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及大鼠急性應(yīng)激抑郁模型的建立：取新生鼠(出生后15 d)、幼年鼠(出生后30 d)和成年鼠(90 d)各20只，組內(nèi)隨機(jī)分為對照組和模型組，各10只。采用慢性不可預(yù)見性輕度應(yīng)激方法(CUMS)建立大鼠抑郁模型，從實驗第1天至第21天，模型組每天接受一種應(yīng)激刺激，包括足底電擊、夾尾、禁水、禁食、冰水游泳、晝夜顛倒等。空白對照組不做任何處理。

1.2.2 曠場實驗(OFT)：應(yīng)用曠場實驗進(jìn)行大鼠自主活動評分：將大鼠置于敞箱裝置中心格內(nèi)，其中敞箱裝置(75 cm ×75 cm ×40 cm)為透明材料制成，底面被等分為25個方格，沒有頂蓋。實驗進(jìn)行時，保持周圍環(huán)境安靜，觀察并記錄大鼠5 min內(nèi)水平運(yùn)動得分(四爪進(jìn)入方格次數(shù))及垂直運(yùn)動得分(前爪騰空或攀附墻壁次數(shù))。徹底清潔敞箱后再進(jìn)行下一只大鼠的觀察。

1.2.3 水迷宮實驗：采用Morris水迷宮定向航行測試(PNT)和空間探索測試(SPT)評價各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。定位航行測試：訓(xùn)練連續(xù)進(jìn)行5 d，每天進(jìn)行4輪訓(xùn)練(每個入水點(diǎn)各1次)，每次2 min，訓(xùn)練間隔大于30 min，記錄大鼠在水迷宮內(nèi)尋找平臺的時間。將大鼠面向池壁分別于4個入水點(diǎn)放入水中，記錄大鼠從入水到找到平臺并站立其上的時間(逃避潛伏期)和在此期間的游泳活動軌跡(即游泳距離)。空間探索測試：定位導(dǎo)航測試結(jié)束后第2天測試大鼠的空間位置記憶能力，具體如下，移去水下平臺，選擇距離平臺最遠(yuǎn)的入水點(diǎn)將大鼠放入水池中，記錄其在120 s內(nèi)跨過原平臺所在位置的次數(shù)。

1.2.4 RT-PCR法檢測各組大鼠海馬及前額皮層組織中NRG1、ErbB4基因的表達(dá)：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法檢測NRG1、ErbB4基因表達(dá)水平。預(yù)變性，變性，退火，延伸，循環(huán)，延伸。同時上樣擴(kuò)增產(chǎn)物和Maker，電泳，銀染，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體重變化情況比較 見表1。與同齡對照組比較，新生、幼年以及成年模型組大鼠在建模10 d及21 d時體重明顯下降(均P<0.05)。

表1 各組大鼠體重變化情況比較(g)

2.2 各組大鼠自主行為評分比較 見表2。與同齡對照組比較，新生模型組與幼年模型組大鼠水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動得分顯著降低(均P<0.05)。與同齡對照組比較，成年模型組大鼠水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動得分無明顯變化(均P>0.05)。與新生模型組比較，幼年及成年模型組大鼠水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動得分顯著增加，成年模型組高于幼年模型組(均P<0.05)。

表2 各組大鼠自主行為評分比較(分)

2.3 各組大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力情況比較 見表3。與同齡對照組比較，新生模型組和幼年模型組大鼠逃避潛伏期和游泳距離顯著增加，穿越平臺次數(shù)顯著降低(均P<0.05)。與同齡對照組比較，成年模型組逃避潛伏期、游泳距離以及穿越平臺次數(shù)無明顯變化(均P>0.05)。與新生模型組比較，幼年及成年模型組大鼠逃避潛伏期和游泳距離顯著降低，幼年模型組高于成年模型組，穿越平臺次數(shù)顯著增加，幼年模型組低于成年模型組(均P<0.05)。

表3 各組大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力情況比較

2.4 各組大鼠海馬、前額皮層組織中NRG1、ErbB4基因表達(dá)水平比較 NRG1、ErbB4以及GAPDH引物設(shè)計見表4。各組大鼠海馬、前額皮層組織中NRG1、ErbB4基因表達(dá)水平情況見表5(圖1)。與同齡對照組比較，新生和幼年模型組大鼠海馬及前額皮層組織中NRG1、ErbB4表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。與同齡對照組比較，成年組大鼠海馬及前額皮層組織中NRG1及 ErbB4表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)。與新生模型組比較，幼年及成年模型組大鼠新生和幼年模型組大鼠海馬及前額皮層組織中NRG1、ErbB4表達(dá)水平顯著降低，幼年模型組低于成年模型組(均P<0.05)。各模型組中海馬及前額皮層組織中NRG1、ErbB4表達(dá)水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。

表4 引物序列設(shè)計

表5 各組大鼠海馬、前額皮層組織中NRG1、ErbB4基因表達(dá)水平比較

圖1 各組大鼠海馬、前額皮層組織中

3 討 論

研究[11]表明，抑郁癥患者認(rèn)知功能損傷呈典型的年齡相關(guān)性，對腦發(fā)育早期(新生兒期及嬰幼兒期)患者認(rèn)知功能的損害更為突出。NRG1是一種ErbB受體酪氨酸激酶的營養(yǎng)因子，可與微清蛋白中間神經(jīng)元高親和力受體ErbB4結(jié)合并激活一系列胞內(nèi)信號通路[12-13]。研究表明[14-16]，NRG1-ErbB4信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，現(xiàn)已被大量學(xué)者鑒定為抑郁癥的易感基因。與成人相比，嬰幼兒處于大腦發(fā)展的黃金時期，其對外界刺激更為敏感。目前關(guān)于不同發(fā)育階段抑郁對大鼠認(rèn)知功能影響的報道較少，其作用機(jī)制也不太清楚。鑒于此，本研究取新生鼠(出生后15 d)、幼年鼠(出生后30 d)和成年鼠(出生后90 d)各20只，組內(nèi)隨機(jī)分為對照組和模型組各10只，采用慢性不可預(yù)見性輕度應(yīng)激(CUMS)建立大鼠抑郁模型。

研究結(jié)果顯示，新生、幼年以及成年模型組大鼠在建模10 d及21 d時體重增長較同齡對照組明顯落后，初步證明CUMS大鼠抑郁模型建立成功，提示抑郁情緒可造成大鼠體重下降。曠場實驗結(jié)果顯示，與同齡對照組相比，新生模型組與幼年模型組大鼠水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動得分均顯著降低。與新生模型組相比，幼年及成年模型組大鼠水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動得分均顯著增加，成年模型組高于幼年模型組。Morris水迷宮測試表明，與同齡對照組相比，新生模型組和幼年模型組大鼠逃避潛伏期和游泳距離顯著增加，穿越平臺次數(shù)顯著降低。與新生模型組相比，幼年及成年模型組大鼠逃避潛伏期和游泳距離顯著降低，幼年模型組高于成年模型組，穿越平臺次數(shù)顯著增加，幼年模型組低于成年模型組。曠場實驗和水迷宮實驗結(jié)果表明抑郁情緒對不同發(fā)育階段的大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力影響程度不同，新生及幼年大鼠對抑郁情緒更加敏感，可顯著降低大鼠的自主活動、學(xué)習(xí)和記憶能力。我們采用RT-PCR法檢測各組大鼠海馬以及前額皮層組織中NRG1、ErbB4基因表達(dá)水平的變化。海馬及前額皮層在抑郁癥等情感障礙中發(fā)揮重要作用，是研究抑郁相關(guān)研究常涉及到的腦區(qū)[17-19]，故本研究選取大鼠海馬及前額皮層作為生化指標(biāo)檢測區(qū)域。與同齡對照組相比，新生和幼年模型組大鼠海馬及前額皮層組織中NRG1、ErbB4表達(dá)水平顯著升高。與新生模型組相比，幼年及成年模型組大鼠新生和幼年模型組大鼠海馬及前額皮層組織中NRG1、ErbB4表達(dá)水平顯著降低，幼年模型組低于成年模型組。各模型組中海馬及前額皮層中NRG1、ErbB4表達(dá)水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異。說明抑郁大鼠海馬及前額皮層組織中NRG1、 ErbB4高表達(dá)，且其水平與年齡可能與年齡有關(guān)，年齡越小，海馬及前額皮層組織中NRG1、 ErbB4越高。由此推測，盡管影響認(rèn)知功能的因素有很多，抑郁可通過影響為不同發(fā)育階段大鼠海馬組織及前額皮層中NRG1、 ErbB4的表達(dá)，導(dǎo)致其學(xué)習(xí)及記憶能力的下降。

綜上所述，抑郁可影響SD大鼠認(rèn)知功能，降低其學(xué)習(xí)及記憶能力，腦發(fā)育早期抑郁對認(rèn)知功能的損害更為明顯，海馬區(qū)及前額皮層組織中NRG1、ErbB4的高表達(dá)可能是抑郁影響大鼠認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶功能的機(jī)制之一。