不同產(chǎn)地茺蔚子飲片超高效液相色譜指紋圖譜研究*

吳世蓉，張 波△，吳文平，李國(guó)衛(wèi)

（1. 安徽省中醫(yī)院，安徽 合肥 230031； 2. 廣東一方制藥有限公司·廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 528244）

茺蔚子為唇形科植物益母草 Leonurus japonicus Houtt. 的干燥成熟果實(shí)，性微寒，味苦、辛，有活血調(diào)經(jīng)、清肝明目之功效，臨床多用于治療月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)來(lái)腹痛、目赤翳障等證［1］。其化學(xué)成分主要包括生物堿、黃酮類、二萜類、強(qiáng)心苷等［2－3］。已有文獻(xiàn)報(bào)道茺蔚子的質(zhì)量控制方法，但多集中于茺蔚子中鹽酸水蘇堿的含量測(cè)定，對(duì)藥材的指紋圖譜研究較少［4－5］。茺蔚子在全國(guó)各地均有分布和種植［6］，市售品產(chǎn)地眾多，質(zhì)量不一，采用單一成分的含量測(cè)定方法來(lái)評(píng)價(jià)，不能全面反映其整體質(zhì)量。本研究中采用超高效液相色譜（UPLC）法對(duì)不同產(chǎn)地茺蔚子飲片進(jìn)行指紋圖譜研究，旨在為更加科學(xué)地制訂茺蔚子飲片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供有效依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters H－Class 型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；HWS28 型恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；ME204E 型電子分析天平（精度為 0.1 mg），XP26 型電子分析天平（精度為 0.001 mg），均購(gòu)自梅特勒－托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 試藥

4－羥基苯甲酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為101149－201903，含量為 100.0%）；甲醇、乙腈、三氟乙酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水；18 批茺蔚子飲片（市售品），經(jīng)安徽省中醫(yī)院李立華主任中藥師鑒定為正品，產(chǎn)地及編號(hào)見表1。

表1 18 批茺蔚子飲片的產(chǎn)地信息Tab.1 Producing habitats of 18 batches of Leonuri Fructus

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WatersHSST3柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－0.1% 三氟乙酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～ 3 min 時(shí) 0 A，3 ～ 15 min 時(shí) 0 A→4%A，15 ～ 22 min時(shí) 4%A→6%A，22 ～ 25 min 時(shí) 6%A→9%A，25 ～28 min 時(shí) 9%A →10%A，28 ～ 40 min 時(shí) 10%A，40 ～40.1 min 時(shí) 10%A→80%A，40.1 ～45 min 時(shí) 80%A）；流速：0.30 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液制備

稱取4－羥基苯甲酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為20 μg／mL 的對(duì)照品溶液。取藥材飲片樣品粉末（過50 目篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，靜置，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，以4－羥基苯甲酸峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的 RSD 均小于3% （ n ＝ 7），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置 0，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以4－羥基苯甲酸峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的 RSD 均小于3%（ n ＝7），表明供試品溶液在室溫放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取藥材飲片樣品（編號(hào)為S1）適量，各6 份，按 2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以4－羥基苯甲酸峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的 RSD 均小于3%（ n ＝ 6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜研究

指紋圖譜建立：取茺蔚子飲片18 批，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，18批茺蔚子飲片的指紋圖譜見圖1。將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.0 版）”軟件，與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行自動(dòng)匹配，即得對(duì)照指紋圖譜，詳見圖2。標(biāo)定共有峰13 個(gè)，各批樣品的共有峰峰面積見表2。通過與對(duì)照品比對(duì)，鑒定出1 個(gè)主成分，詳見圖3。

表2 18 批茺蔚子飲片超高效液相色譜圖共有峰的相對(duì)峰面積Tab.2 Relative peak areas of common peaks in 18 batches of Leonuri Fructus by UPLC

圖1 18 批茺蔚子飲片超高效液相色譜圖疊加指紋圖譜Fig.1 UPLC superimposed fingerprints of 18 batches of Leonuri Fructus

圖2 茺蔚子飲片超高效液相色譜圖對(duì)照指紋圖譜Fig.2 UPLC reference fingerprint of Leonuri Fructus

圖3 對(duì)照品溶液高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of the reference solution

相似度計(jì)算：將18 批茺蔚子飲片的指紋圖譜均導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.0 版）”軟件，計(jì)算相似度。結(jié)果18 批飲片與對(duì)照指紋圖譜的相似度范圍為 0.801 ～0.982，僅玉林市的 3 批與對(duì)照指紋圖譜相似度小于0.88（表3），表明各產(chǎn)地飲片質(zhì)量較接近。

表3 18 批茺蔚子飲片指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.3 Similarity evaluation of fingerprints of 18 batches of Leonuri Fructus

聚類分析：采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分別對(duì)18批茺蔚子飲片進(jìn)行聚類，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以?shī)A角余弦作為相似度的判定公式。結(jié)果，18 批飲片樣品聚為 3 類，Ⅰ類包括 S7，S8，S16，S17，S18（信陽(yáng)市 2 批、臨沂市 3 批）；Ⅱ類包括 S1，S2，S3，S4，S5，S6，S12，S13，S14，S15（綏化市 4 批、信陽(yáng)市 3 批、南陽(yáng)市 3 批）；Ⅲ類包括 S9，S10，S11（均來(lái)自玉林市）。詳見圖 4。

圖4 18 批茺蔚子飲片聚類分析結(jié)果Fig.4 Results of cluster analysis of 18 batches of Leonuri Fructus

共有峰主成分分析：采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分別對(duì)18 批茺蔚子飲片指紋圖譜所得的13 個(gè)共有峰進(jìn)行主成分分析，得出相關(guān)矩陣的特征值及其方差，詳見表 4。可見，前 3 個(gè)成分的特征值分別為 6.446，2.124，1.437，對(duì)總方差的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)76.981%，基本保留了原樣本的信息，故確定提取的主成分有3 個(gè)。主成分1 主要影響因素為色譜峰 4，10，12，主成分 2 為色譜峰2，3，主成分 3 為色譜峰 6，7，故用前 3 個(gè)主成分即可表示原UPLC 數(shù)據(jù)的主要信息，詳見表5。權(quán)重值的前3 名變量分別為 0.942，0.933，0.887，對(duì)應(yīng)色譜峰 12，4，10，即為判斷不同產(chǎn)地茺蔚子飲片質(zhì)量的重要因素。

表4 特征根、各主成分的貢獻(xiàn)率Tab.4 Contribution rate of characteristic root and each principal components

表5 各因子初始因子載荷矩陣Tab.5 Initial factor load matrix of each factor

不同產(chǎn)地茺蔚子飲片綜合評(píng)價(jià)：針對(duì)前3 個(gè)主成分對(duì)茺蔚子飲片進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，按方差貢獻(xiàn)率加權(quán)計(jì)算綜合得分，結(jié)果見表6。排名前5 的樣品中包括臨沂市的3批和信陽(yáng)市的2 批；排名前5 ～10 的樣品中包括綏化市的3 批和信陽(yáng)市的2 批。總體來(lái)說，臨沂市的茺蔚子飲片質(zhì)量較優(yōu)且穩(wěn)定；玉林市的整體質(zhì)量較差，綜合排名靠后；南陽(yáng)市的質(zhì)量一般且穩(wěn)定；信陽(yáng)市的質(zhì)量不是很均勻，有優(yōu)有劣。由三維得分散點(diǎn)圖可知，18 批飲片可分為 3 類，其中，Ⅰ類包括 S7，S8，S16，S17，S18（信陽(yáng)市2 批、臨沂市 3 批）；Ⅱ類包括 S1，S2，S3，S12，S13，S14，S15（綏化市 4 批、南陽(yáng)市 3 批 ）；Ⅲ類包括 S4，S5，S6，S9，S10，S11（玉林市、信陽(yáng)市各 3 批）。詳見圖 5。

表6 主成分得分、綜合得分及排序Tab.6 Principal components scores，comprehensive scores and their ranking

圖5 主成分三維得分散點(diǎn)圖Fig.5 3D scatter plot of principal components

3 討論

3.1 供試品制備方法及液相色譜條件優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)中對(duì)不同提取溶劑（無(wú)水甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇）的提取效果進(jìn)行了比較，結(jié)果70%甲醇提取的色譜峰信息更豐富，峰面積響應(yīng)值較高且基線相對(duì)平穩(wěn)。對(duì)不同提取方式（超聲提取、加熱回流提取）、不同提取時(shí)間（15，30，60 min）的考察結(jié)果表明，加熱回流提取30 min 的提取效果較好。前期研究中發(fā)現(xiàn)，茺蔚子的化學(xué)成分較豐富，考慮采用HPLC 法的分析時(shí)間可能較長(zhǎng)，故采用UPLC 法分析，通過對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終在45 min 內(nèi)完成對(duì)圖譜的分析，并確定13 個(gè)共有峰，在保證全面反映茺蔚子飲片全貌的前提下，提高了分析效率。

3.2 特征圖譜測(cè)定結(jié)果

目前，茺蔚子的研究主要針對(duì)茺蔚子的生物堿、氨基酸、脂肪酸等成分進(jìn)行分析［5，7－11］。本研究中通過建立茺蔚子飲片UPLC 指紋圖譜，對(duì)茺蔚子飲片的成分進(jìn)行了較全面地分析，18 批茺蔚子飲片與對(duì)照指紋圖譜的相似度范圍為 0.801 ～0.982，15 批飲片與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.88 以上，為不同產(chǎn)地茺蔚子飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考。2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》茺蔚子項(xiàng)下規(guī)定的含量測(cè)定指標(biāo)為鹽酸水蘇堿，預(yù)試驗(yàn)中未找到與鹽酸水蘇堿對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，通過與現(xiàn)有文獻(xiàn)比對(duì)，推測(cè)可能原因是鹽酸水蘇堿為末端吸收，檢測(cè)波長(zhǎng)多以192 nm 為主，本研究中為能反映茺蔚子飲片的整體成分，選擇了色譜峰信息較豐富的254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。另外，鹽酸水蘇堿在茺蔚子中的含量較低，藥典檢測(cè)方法中需經(jīng)中性氧化鋁柱純化富集，本研究為全面反映茺蔚子飲片質(zhì)量的全貌，故采用超聲提取。本研究中通過對(duì)照方式確定了1 個(gè)成分，即4－羥基苯甲酸，最終確定為參照峰，提高了方法的專屬性和耐用性。

3.3 聚類分析及主成分分析結(jié)果

以往對(duì)中藥材樣品僅進(jìn)行含量測(cè)定或指紋圖譜等常規(guī)化學(xué)試驗(yàn)分析，易忽略中藥材質(zhì)量與其性狀、產(chǎn)地、采收、加工等因素的關(guān)聯(lián)，近年來(lái)，通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方式能進(jìn)一步挖掘中藥材的質(zhì)量與性狀、產(chǎn)地、采收、加工等因素間的聯(lián)系，為中藥材的質(zhì)量研究提供了新的分析手段。本研究中在建立茺蔚子飲片UPLC 指紋圖譜的基礎(chǔ)上，通過聚類分析、主成分分析進(jìn)一步挖掘樣品質(zhì)量與產(chǎn)地間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，茺蔚子飲片不同產(chǎn)地間存在顯著差異，建立的化學(xué)識(shí)別模式可對(duì)不同產(chǎn)地的茺蔚子飲片進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)，不同產(chǎn)地茺蔚子飲片大致可分為3 類，其中臨沂市所產(chǎn)的茺蔚子飲片在2 種評(píng)價(jià)方法中均能穩(wěn)定地分為1 類，且主成分綜合評(píng)分排名靠前，說明該產(chǎn)地飲片樣品質(zhì)優(yōu)且穩(wěn)定；而玉林市的3 批樣品排名靠后，原因可能與茺蔚子飲片產(chǎn)地的南北分布有關(guān)。該結(jié)論與多項(xiàng)研究結(jié)果［4，12－16］基本一致，說明所建立的方法具有一定的科學(xué)性和合理性，可用于茺蔚子飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中共收集了全國(guó)5 個(gè)不同產(chǎn)地共18 批茺蔚子飲片，樣品具有一定的代表性，基本可反映茺蔚子飲片的整體性與差異性。中藥飲片質(zhì)量易受生長(zhǎng)環(huán)境、土壤性質(zhì)、氣候等因素影響，因此，通過運(yùn)用聚類分析、主成分分析等評(píng)價(jià)手段，建立全面、客觀、科學(xué)的茺蔚子質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，可為茺蔚子飲片的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量控制提供參考。