高效分子排阻色譜法測定滇黃精多糖的分子量*

顧 健 ，吳 偉 ，沈志沖 ，劉江云

（1. 江蘇省南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 南通 226007； 2. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

黃精收載于2020 年版《中國藥典（一部）》，為百合科植物滇黃精 Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黃精 Polygonatum sibiricum Red. 或多花黃精 Polygonatum cyrtonema Hua 的干燥根莖［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、潤肺益腎功效。漢代《名醫(yī)別錄》記載，黃精為藥食同源中藥。黃精對(duì)免疫功能低下、惡性腫瘤、抑郁癥、糖尿病、老年癡呆等都有一定的輔助治療作用。其主要功效成分黃精多糖［2－6］為由葡萄糖單元為主構(gòu)成的高分子聚合物，結(jié)構(gòu)組成特征可為質(zhì)量分析提供基礎(chǔ)［7－9］。滇黃精為云南的道地藥材，個(gè)大，多糖含量高，市場占有率最高［10－12］。本研究中建立了測定滇黃精中黃精多糖分子量的高效分子排阻色譜（HPSEC）法，為滇黃精的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)［13－14］。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國 Agilent 公司），配有Shodex RI－101 型示差檢測器（日本島津公司）和EC2000 GPC 軟件（大連依利特分析儀器有限公司）；LE204E 型分析天平（瑞士 Mettler 公司，精度為0.000 1 g）；TC6K 型電子天平（雙杰兄弟集團(tuán)，精度為0.1 g）。

1.2 試藥

滇黃精藥材采自云南普洱，經(jīng)蘇州大學(xué)陸葉副教授鑒定為滇黃精 Polygonatum kingianum coll.et Hemsl. 的根莖。葡聚糖包括 T2000，T200，T110，T70，T40，T20，T10，重均分子量（ Mw）見表1，購自默克試劑公司；葡萄糖（分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［15］

色譜柱：TSKG3000PWXL 型凝膠柱（300mm×7.8mm，10 μm），配有 Shodex RI－101 型示差檢測器；檢測波長：210 nm；流動(dòng)相：純水；流速：0.5 mL ／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。在此色譜條件下，測得葡聚糖2 000 的保留時(shí)間（tR）為 9.43 min，葡萄糖的 tR為 19.16 min。葡聚糖對(duì)照品 T200 ～T10 和黃精多糖樣品的 tR值均在9.43 ～ 19.16 min 范圍內(nèi)。

2.2 樣品與溶液制備

滇黃精多糖樣品：取滇黃精藥材500 g，用蒸餾水5 L回流提取1.5 h，殘?jiān)ɑ亓? 次，合并提取液，緩慢添加乙醇至終濃度50%，靜置過夜，過濾，60 ℃干燥得黃精多糖組分PK－F1 43.6 g；濾液繼續(xù)添加乙醇至終濃度75%，同法靜置，過濾，干燥得組分PK－F2 31.2 g；濾液濃縮至250 mL，同法添加乙醇至終濃度90%，靜置，過濾，干燥得組分 PK－F3 16.8 g。

對(duì)照品溶液：分別取1.2 項(xiàng)下葡聚糖各25mg，置5mL容量瓶中，加水加熱溶解，定容，即得。

供試品溶液：分別取上述PK－F1，PK－F2，PK－F3樣品各25 mg，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，加水加熱溶解，定容，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：吸取2.2 項(xiàng)下系列葡聚糖對(duì)照品溶液進(jìn)樣檢測，記錄色譜峰的 tR。以葡聚糖的 tR為橫坐標(biāo)、Mw 的對(duì)數(shù)值（lg Mw）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 lg Mw ＝ － 0.346 9 tR＋ 8.823 7（R2＝ 0.995 5），表明該條件下線性符合要求。詳見表1。

表1 葡聚糖對(duì)照品線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.1 Results of linear relation test of dextran reference

精密度試驗(yàn)：吸取2.2 項(xiàng)下葡聚糖T110 對(duì)照品溶液 20 μL，進(jìn)樣 6 次，記錄色譜峰的 tR。結(jié)果葡聚糖T110 的平均 tR為 10.50 min，RSD 為 0.84% （n ＝ 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取PK－F1 供試品溶液適量，于室溫下 0，2，4，6，8，10，12 h 時(shí)進(jìn)樣分析，記錄樣品的 tR。結(jié)果PK－F1 供試品溶液的平均 tR為 10.47 min，RSD為 1.42%（n ＝6），表明方法穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取PK－F1 供試品適量，精密稱定，共6 份，依法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄樣品的 tR。結(jié)果PK－F1 的平均 tR為10.51min，RSD 為 0.86%（n ＝ 6），表明方法重復(fù)性良好。

檢測限確定：按葡萄糖的3 倍基線噪音值計(jì)算，按2.1 項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果檢測限為 0.021 μg ／mL。

2.4 樣品含量測定

吸取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，注入液相色譜儀，測定 tR，計(jì)算分子量。結(jié)果見圖1。PK－F1 和PK－F2 的主峰相似，其中，P1 的 tR為 10.55 min，Mw 為 145 850；P2的 tR為 12.78 min，Mw 為 24 565。PK －F3 中 P3 的 tR為 16.91 min，Mw 為 907。

圖1 高效分子排阻色譜圖1.P1 2.P2 3. P3A. PK －F1 test solution B.PK －F2 test solution C.PK －F3 test solutionFig.1 HPSEC chromatograms

3 討論

黃精多糖為黃精的主要有效成分，現(xiàn)知已有結(jié)構(gòu)為葡萄糖單元為主的多糖聚合物，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，類型多樣，對(duì)其質(zhì)量分析方法有待深入研究。分子量是多糖重要的特征性參數(shù)，本研究中采用系列分子量的葡聚糖為對(duì)照，分別測定了3 個(gè)滇黃精多糖醇沉物樣品的 Mw，由2.4 項(xiàng)下樣品含量測定可知，PK －F1 的 Mw 為 14 5850，未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其結(jié)構(gòu)需做進(jìn)一步分析。

黃精多糖作為滇黃精的主要有效成分，為滇黃精質(zhì)量評(píng)定的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中通過HPSEC 法，測定了滇黃精多糖的分子量，為進(jìn)一步探討其結(jié)構(gòu)提供了參考。本方法簡易快速，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，為滇黃精分子量測定的有效方法。