山苦荬高效液相色譜指紋圖譜研究*

孫麗君 ，王玉華 ，李瑞娟 ，王秋桐

（1. 內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110； 2. 內蒙古醫科大學附屬醫院藥物臨床試驗機構，內蒙古呼和浩特 010110）

山苦荬 Ixeris chinensis （Thunb. ） Nakai 為菊科 Compositae 苦荬菜屬 Ixeris 植物，蒙藥材名為蘇素－烏布斯，在內蒙古自治區分布廣泛，收載于《內蒙古蒙藥材標準》［1］，具有抑協日、清熱作用，蒙醫臨床多用于治療肝膽熱、肝炎等疾病［2－4］。現代藥理學研究表明，山苦荬具有抗腫瘤活性、鎮痛、保肝、免疫調節、抗氧化等作用［5－6］。其所含成分復雜，主要包括黃酮類、倍半萜內酯類、三萜皂苷類等化合物［6－7］。本研究中檢測了12 批山苦荬藥材的指紋圖譜，并采用化學計量學分析法分析隱藏信息，尋找并區分不同品質山苦荬的標志性成分，為該藥材的質量評價提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Fisher UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；AL204 型分析天平（美國Mettler Toledo 公司，精度為十萬分之一）；KQ－250DA型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為 350 W，頻率為 36 ～ 44 kHz）。

1.2 試藥

木犀草苷（中國食品藥品檢定研究院，批號為111720 －200905）；乙腈、甲醇（Fisher 公司）為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水；12 批不同產地的山苦荬采自山西、內蒙古自治區不同盟市，經內蒙古醫科大學藥學院龐秀生教授鑒定為菊科苦荬菜屬植物山苦荬 Ixeris chinensis （Thunb. ） Nakai。藥材均密封保存于陰涼干燥處，藥材來源見表1。

2 方法與結果

2.1 溶液制備［8 －9］

取木犀草苷適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含0.102 mg 的溶液，即得對照品溶液。取山苦荬藥材粉末（過4 號篩）1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加60%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理40 min，放至室溫，再稱定質量，用60%甲醇補足減失的質量，加入0.5 mL 磷酸，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2 山苦荬指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Apollo C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.04%磷酸溶液（A）－乙腈（B），梯度洗脫（0 ～5 min時 100%A→90%A，5 ～ 8 min 時 90%A→85%A，8 ～28 min 時 85%A→75%A，28 ～41 min 時 75%A→70%A，41 ～ 43 min 時 70%A→69%A，43 ～60 min 時 69%A→50%A）；流速：0.8 mL ／ min；柱溫：30 ℃ ；檢測波長：220 nm；進樣量：20 μL。

2.2.2 指紋圖譜建立及相似度評價［10－13］

取12 批山苦荬藥材，按2.1 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A 版）軟件分析12 批山苦荬藥材的色譜數據，以S12 號樣品的色譜圖作為參照譜圖，時間窗寬度為0.10，采用多點校正的方式，得到12 批山苦荬藥材的疊加圖譜（見圖1）；以12 批藥材的共有模式為對照色譜圖，共標定17 個共有峰（見圖2）；通過對照，指認出10 號峰為木犀草苷峰，峰面積適中，且不同批次樣品中穩定存在，故選其作為參比峰（見圖3）。將12 批山苦荬藥材與對照圖譜進行相似度比較，結果 17 個共有峰的相似度介于 0.914 ～0.992（r ＝1.000），表明不同批次山苦荬藥材的化學成分均較穩定。

圖1 12 批山苦荬藥材的高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 12 batches of Ixeris chinensis

圖2 山苦荬藥材的共有模式圖譜Fig.2 Common pattern of Ixeris chinensis

圖3 山苦荬藥材與木犀草苷對照品的對比色譜圖Fig.3 Contrast chromatogram of Ixeris chinensis and luteoloside

2.2.3 方法學考察

精密度試驗：取S12 號山苦荬藥材適量，精密稱定，按 2.1 項下方法制備供試品溶液，按 2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次。結果以10 號峰為參比峰，各共有峰相對保留時間及相對峰面積的 RSD 均小于2.00%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取S12 號山苦荬藥材適量，精密稱定，按 2.1 項下方法制備供試品溶液，按 2.2.1 項下色譜條件，分別于 0，3.5，7.0，10.5，14.0 h 時進樣測定。結果以10 號峰為參比峰，各共有峰相對保留時間及相對峰面積的 RSD 均小于 3.00%（n ＝ 5），表明供試品溶液在14 h 內穩定。

重復性試驗：取S12 號山苦荬藥材適量，精密稱定，按2.1 項下方法制備供試品溶液，平行6 份，分別按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果以10 號峰為參比峰，測得各共有峰相對保留時間及相對峰面積的 RSD均小于 3.00%（n ＝6），表明方法重復性良好。

2.3 化學計量學分析［14 －15］

聚類分析：將12 批山苦荬藥材共有峰峰面積的色譜數據導入SPSS 26.0 統計學軟件，使用沃德聯接譜系圖重新標度的距離聚類組合，采用平方歐氏距離對藥材進行系統聚類分析（見圖4）。結果顯示，12 批山苦荬藥材大致分為 4 類，Ⅰ類包括 S1，S2，S7，S8，S9，S10，S12；Ⅱ類包括 S3，S6；Ⅲ類包括 S5，S11；Ⅳ類包括 S4。結合表1 可知，S4 和S5 均采自內蒙古自治區赤峰市，但S4 單獨聚為了一類。可見，即便是同一產地，也有個別批次的藥材質量存在較大差異。

圖4 12 批山苦荬藥材的聚類分析結果Fig.4 Dendrogram of cluster analysis of 12 batches of Ixeris chinensis

主成分分析：以12 批山苦荬藥材中17 個共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA－P 軟件進行主成分分析，以主成分的特征根和貢獻率作為選擇主成分的依據，模型自動擬合選擇 4 個主成分，其特征根分別為6.79，2.21，1.20，1.02，方 差 貢 獻 率 分 別 為 56.60% ，18.40% ，10.00% ，8.52% ，累 積 方 差 貢 獻 率 大 于93.50%，提示模型預測良好。詳見圖5。可見，12 批山苦荬藥材被分為4 類，與聚類分析結果一致。

圖5 12 批山苦荬藥材的主成分分析得分圖Fig.5 PCA score chart of 12 batches of Ixeris chinensis

偏最小二乘回歸分析（PLS－DA）：采用SIMCA－P軟件建立PLS－DA 模型，采用監督模式識別法進行兩組間的PLS－DA。結果見圖6 和圖7。PLS－DA 模型得分圖顯示，樣品可很好地區分為4 類，與聚類分析、主成分分析結果一致。以模型變量投影（VIP）值為指標，對引起組間差異的成分進行分析，VIP 圖可反映出每個峰的貢獻程度。以 VIP ＞1 為原則，得出 1，2，5，7，8，10，11，13，15 號峰可能是區分樣品最關鍵的色譜峰，對樣品分類作用較大。

圖6 12 批山苦荬藥材的PLS－DA 模型得分圖Fig.6 PLS －DA score chart of 12 batches of Ixeris chinensis

圖7 12 批山苦荬藥材的PLS－DA 結果Fig.7 PLS －DA results of 12 batches of Ixeris chinensis

3 討論

3.1 提取方法考察

本試驗中分別對提取溶劑（20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、100%甲醇）、提取方式（超聲提取和加熱回流提取），以及提取時間（30，40，50 min）進行了考察，以色譜峰信息的最大化、提取效率高為指標，最終確定山苦荬的最佳提取方式為以60%甲醇為提取溶劑，超聲提取40min。

3.2 色譜條件考察［16］

本試驗中分別對色譜條件中的流動相體系（乙腈－0.04%磷酸溶液、甲醇－水、甲醇－0.02%磷酸溶液、甲醇－0.04%磷酸溶液、甲醇－0.06%磷酸溶液、甲醇－0.08%磷酸溶液、甲醇－0.1%磷酸溶液）、檢測波長（全波長掃描），以及柱溫（20，25，30，35 ℃ ）和流速（1.0，0.8 mL／min）進行了考察，以色譜峰數、峰面積和分離效果為指標，最終確定了2.2.1 項下的色譜條件。

3.3 方法評價

本研究中建立了山苦荬藥材的高效液相色譜指紋圖譜，并結合化學計量學分析法進行分析，結果顯示，該藥材中 1，2，5，7，8，10，11，13，15 號色譜峰對應的 9 個成分受生長環境的影響較大，可能為山苦荬中起決定性作用的化學成分，可全面反映內蒙古自治區范圍內不同盟市山苦荬藥材的質量差異，進而為完善山苦荬的地方質量標準提供參考。