酶聯(lián)美拉德反應(yīng)制備天然烤花生風(fēng)味物質(zhì)的研究

莊榮旭，馬穎川，賴升敬，羅妍，汪薇,2*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣州 510225；2.廣東省香精香料(仲愷)工程技術(shù)研究中心，廣州 510225；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642；4.廣東省鹽業(yè)集團(tuán)揭陽(yáng)有限公司，廣東 揭陽(yáng) 522000)

中國(guó)是世界上重要的花生生產(chǎn)國(guó)，總產(chǎn)量占世界花生產(chǎn)量的40%，居第一位，其中國(guó)內(nèi)消費(fèi)占總產(chǎn)量的95%以上。花生是一種廣受消費(fèi)者歡迎的食品，特別是在焙烤過(guò)程中產(chǎn)生的特殊風(fēng)味深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1-2]。

近年來(lái)，隨著人們消費(fèi)觀念的改變及消費(fèi)水平的提高，天然香精以其綠色、天然、安全、環(huán)保等特點(diǎn)日益受到人們的青睞。烤花生香精是食品生產(chǎn)中一種重要的香味劑，能夠賦予食品特殊的烤花生香味，具有極大的市場(chǎng)潛力，可以廣泛應(yīng)用于花生醬、花生味飲料、花生味蛋糕、花生味冰淇淋等食品中[3]。

目前有一些學(xué)者對(duì)花生風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了研究，黃文等用蛋白酶對(duì)脫脂花生進(jìn)行酶解，然后與葡萄糖在丙二醇溶液中反應(yīng)，以獲得焙烤花生的香味[4]；在Gannis等的專利中采用加熱浸泡過(guò)花生的丙三醇和水的混合溶液來(lái)制備花生風(fēng)味[5]。但是這些研究中使用了有機(jī)溶劑，從安全的角度來(lái)看有所欠缺。陳文偉等采用花生粕酶解液與葡萄糖、氨基酸和硫胺素等在花生油中進(jìn)行熱反應(yīng)，制備了花生香精，并通過(guò)GC-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其主要呈香成分為吡嗪類、噻唑類、吡喃類化合物[6]。侯振建等的專利中通過(guò)熱反應(yīng)制備了花生香精，具有濃郁的堅(jiān)果香氣，適用于咸味食品[7]。而吳肖等則采用花生粕蛋白酶解液進(jìn)行Maillard 反應(yīng)后合成了肉類香味料[8]。

通過(guò)對(duì)花生風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)性成分研究發(fā)現(xiàn)，主要風(fēng)味成分除了吡嗪類化合物外，還有大量的醛類、酮類、酯類以及烯類化合物，其中苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛是花生風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)[9-11]。

雖然美拉德反應(yīng)在天然風(fēng)味物質(zhì)的制備上應(yīng)用廣泛，但是在天然烤花生風(fēng)味物質(zhì)的制備上應(yīng)用的并不是很多。本研究以花生為原料，采用酶聯(lián)美拉德反應(yīng)，以期獲得天然烤花生風(fēng)味物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

花生：市售；諾維信風(fēng)味蛋白酶和Novozym 37071水解蛋白酶：購(gòu)于廣州明曜商貿(mào)有限公司；Protease MSD、Protease A-2SD、Protamex、Lipase AY 30G、Lipase G50、Lipase MER、Lipase R：均由天野酶制劑(江蘇)有限公司上海分公司贈(zèng)送；L-脯氨酸：購(gòu)于衡水昌昊生物科技有限公司；L-精氨酸(≥99%)、L-丙氨酸(≥99%)、L-纈氨酸(≥99%)：購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；L-賴氨酸(98%)、L-甘氨酸(≥99%)、L-天門(mén)冬氨酸(≥99%)、L-谷氨酸(≥99.5%)、D-木糖(98%)：購(gòu)于上海晶純生化科技股份有限公司；蔗糖、葡萄糖：購(gòu)于廣州一馬科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生預(yù)處理

將一定量的花生仁置于烘烤托盤(pán)中，然后放入遠(yuǎn)紅外線食品烘爐中于120 ℃烘烤1 h，自然冷卻后，去紅衣，用打粉機(jī)進(jìn)行打粉，然后裝于保鮮袋中密封，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶解

用天平稱取一定量的花生粉置于錐形瓶中，按一定的比例加入蒸餾水，搖勻后靜置10 min。待充分浸透后，置于90 ℃恒溫水浴鍋中水浴20 min。取出后冷卻至室溫，加入一定量的蛋白酶和脂肪酶，置于恒溫?fù)u床中酶解一定的時(shí)間，取出，于90 ℃滅酶 10 min。自然冷卻至室溫后，于3000 r/min離心15 min，取上清，待用。

1.2.3 美拉德反應(yīng)

取酶解液，加入一定量的氨基酸和糖，在一定的溫度下反應(yīng)一定的時(shí)間后，于3000 r/min離心15 min，取上清，待用。

1.2.4 褐變程度的測(cè)定

取適當(dāng)稀釋的樣液置于比色皿中，于420 nm的波長(zhǎng)下，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，其中吸光值反映出褐變程度。

1.2.5 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

由5位感官評(píng)價(jià)成員對(duì)實(shí)驗(yàn)所得樣品的風(fēng)味進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表Table 1 The sensory evaluation standard

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件對(duì)酶解效果的影響

2.1.1 蛋白酶的種類對(duì)酶解效果的影響

蛋白酶可將花生中的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，產(chǎn)生多肽及氨基酸等風(fēng)味物質(zhì)。不同蛋白酶的酶解位點(diǎn)不同，會(huì)得到不同的酶解產(chǎn)物，從而得到具有不同風(fēng)味的產(chǎn)物。

表2 蛋白酶的種類對(duì)酶解效果的影響Table 2 Effect of proteases＇ types on the enzymolysis effect

由表2可知，經(jīng)諾維信風(fēng)味蛋白酶酶解之后，其產(chǎn)物具有較濃郁的烤花生味和焦糖味，油脂味較淡，無(wú)不良的風(fēng)味，且風(fēng)味協(xié)調(diào)性好，優(yōu)于其他幾種蛋白酶。這可能是因?yàn)橹Z維信風(fēng)味蛋白酶同時(shí)具備內(nèi)切酶和外切酶的活性，能得到較豐富的風(fēng)味物質(zhì)，較好地提升了酶解物的感官品質(zhì)。綜合考慮，最適的蛋白酶以諾維信風(fēng)味蛋白酶為宜。

2.1.2 脂肪酶種類對(duì)酶解效果的影響

脂肪酶的種類對(duì)酶解效果會(huì)產(chǎn)生較大影響，結(jié)果見(jiàn)表3。其中，Lipase MER和Lipase R的酶解產(chǎn)物都具有較濃郁的烤花生風(fēng)味，且沒(méi)有明顯的油脂味。但是在風(fēng)味的協(xié)調(diào)性上，Lipase MER要優(yōu)于Lipase R，這可能是因?yàn)長(zhǎng)ipase MER對(duì)中短鏈脂肪酸具有較強(qiáng)的水解能力，能產(chǎn)生烤花生風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)。綜合考慮，最適的脂肪酶以Lipase MER脂肪酶為宜。

表3 脂肪酶種類對(duì)酶解效果的影響Table 3 Effect of lipases＇ types on the enzymolysis effect

2.1.3 酶的比例對(duì)酶解效果的影響

表4 酶的比例對(duì)酶解效果的影響Table 4 Effect of ratios of proteases and lipases on the enzymolysis effect

由表4可知，當(dāng)?shù)鞍酌负椭久傅谋壤∮?∶1時(shí)，隨著脂肪酶比例的增加，焦糖味和烤花生味均隨之增強(qiáng)，但是當(dāng)比例大于1∶1時(shí)，隨著脂肪酶比例的增加，焦糖味和烤花生味均隨之減弱。因此可見(jiàn)，當(dāng)加入的蛋白酶和脂肪酶的比例為1∶1時(shí)，烤花生味較濃郁，焦糖味和油脂味適中，風(fēng)味協(xié)調(diào)性好。綜合考慮，復(fù)合酶的最適比例以1∶1為宜。

2.1.4 酶濃度對(duì)酶解效果的影響

表5 酶濃度對(duì)酶解效果的影響Table 5 Effect of content of enzymes on the enzymolysis effect

由表5可知，當(dāng)酶濃度小于0.3%時(shí)，隨著酶濃度的增加，產(chǎn)物的烤花生味顯著增加，焦糖味和油脂味略有增加，風(fēng)味協(xié)調(diào)性也隨之增加。但是當(dāng)酶濃度大于0.3%時(shí)，烤花生味、焦糖味和油脂味均迅速下降，風(fēng)味的協(xié)調(diào)性也隨之下降。綜合考慮，最適的酶濃度以0.30%為宜。

2.1.5 料液比對(duì)酶解效果的影響

表6 料液比對(duì)酶解效果的影響Table 6 Effect of solid-liquid ratios on the enzymolysis effect

由表6可知，當(dāng)料液比小于1∶3時(shí)，隨著料液比的增加，烤花生味、焦糖味和油脂味迅速增加，風(fēng)味協(xié)調(diào)性增強(qiáng)；而當(dāng)料液比大于1∶3時(shí)，烤花生味、焦糖味和油脂味又呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)榱弦罕冗^(guò)低時(shí)，反應(yīng)體系的流動(dòng)性較差，不利于反應(yīng)的發(fā)生；而料液比過(guò)高時(shí)，又會(huì)稀釋底物和產(chǎn)物濃度，減緩反應(yīng)速度。綜合考慮，最適的料液比以1∶3為宜。

2.1.6 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

表7 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響Table 7 Effect of enzymatic hydrolysis time on the enzymolysis effect

由表7可知，當(dāng)酶解時(shí)間小于7 h時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增加，產(chǎn)物的烤花生味、焦糖味及風(fēng)味協(xié)調(diào)性均隨之上升；當(dāng)酶解時(shí)間大于7 h時(shí)，隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)增加，產(chǎn)物的烤花生風(fēng)味和焦糖味稍有下降，油脂味明顯下降，而且風(fēng)味協(xié)調(diào)性下降比較明顯，可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，將反應(yīng)物中的大量油脂降解產(chǎn)生中短鏈脂肪酸所致。綜合考慮，最適的酶解時(shí)間以7 h為宜。

2.2 美拉德反應(yīng)條件對(duì)花生類風(fēng)味物質(zhì)的影響

美拉德反應(yīng)也稱羰氨反應(yīng)，是一種非酶褐變，本質(zhì)上是羰氨間的縮合反應(yīng)，主要指的是醛、酮、還原糖的羰基與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等含氮化合物的游離氨基之間發(fā)生的一系列反應(yīng)，此反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生許多美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，如揮發(fā)性香氣物質(zhì)、高活性且有紫外吸收的中間產(chǎn)物和復(fù)雜的黑色高分子聚合物蛋白黑素等。

通過(guò)控制原材料、溫度及加工方法，美拉德反應(yīng)可制備各種不同風(fēng)味、香味的物質(zhì)。主要是采用還原糖和食品級(jí)的氮源如氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、植物水解蛋白及酵母提取物等多種物質(zhì)混合加熱制備所需的食品風(fēng)味物質(zhì)。此外，美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的香精香氣飽滿、醇厚味濃郁及仿真度較高[12-17]，因此，在食品風(fēng)味物質(zhì)的制備上被廣泛應(yīng)用。

2.2.1 氨基酸種類的影響

不同的氨基酸與還原糖通過(guò)美拉德反應(yīng)能夠產(chǎn)生不同的特征風(fēng)味，如臘肉、鵝肉、咖啡風(fēng)味香精等。本研究選擇了脯氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、甘氨酸、天門(mén)冬氨酸8種氨基酸分別與D-木糖和酶解液于110 ℃反應(yīng)60 min，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 氨基酸種類對(duì)美拉德反應(yīng)的影響Table 8 Effect of amino acids＇ types on the Maillard reaction

由表8可知，谷氨酸的加入有助于花生香味的增強(qiáng)，且油脂味微弱，風(fēng)味協(xié)調(diào)性良好，感官評(píng)分總得分為13.5分，其他氨基酸反應(yīng)后，所得產(chǎn)物的烤花生味較淡，且還會(huì)產(chǎn)生其他異味。此外，產(chǎn)物的吸光值可反映美拉德反應(yīng)的褐變程度。谷氨酸所對(duì)應(yīng)產(chǎn)物的吸光值最低，說(shuō)明其褐變程度較低。綜合考慮，最適的氨基酸以谷氨酸為宜。

2.2.2 糖種類的影響

本實(shí)驗(yàn)選取了蔗糖、D-木糖和葡萄糖分別參與美拉德反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 糖種類對(duì)美拉德反應(yīng)的影響Table 9 Effect of saccharides＇ types on the Maillard reaction

由表9可知，D-木糖的加入有助于烤花生風(fēng)味的產(chǎn)生，沒(méi)有產(chǎn)生雜味，風(fēng)味協(xié)調(diào)性較好，感官評(píng)分總得分為14.5分；加入葡萄糖反應(yīng)后的產(chǎn)物雖也沒(méi)有雜味，但其產(chǎn)物的花生風(fēng)味較弱，感官評(píng)分總得分為10.5分。綜合考慮，最適的糖以D-木糖為宜。

2.2.3 谷氨酸添加量的影響

表10 谷氨酸添加量對(duì)美拉德反應(yīng)的影響Table 10 Effect of additive amount of glutamate on the Maillard reaction

由表10可知，當(dāng)谷氨酸的用量小于1.5%時(shí)，隨著谷氨酸用量的增加，烤花生風(fēng)味物質(zhì)的味道越來(lái)越濃，但是其添加量達(dá)到1.5%時(shí)，同時(shí)產(chǎn)生了明顯的異味，破壞了產(chǎn)物的風(fēng)味協(xié)調(diào)性。當(dāng)谷氨酸的用量大于1.5%時(shí)，隨著谷氨酸用量的增加，烤花生風(fēng)味逐漸減弱，而酸味增強(qiáng)。綜合考慮，最適的谷氨酸用量以花生粉質(zhì)量的1.0%為宜，其反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值為1.3，風(fēng)味較好的產(chǎn)物吸光值大約在1.3～2.0范圍內(nèi)。

2.2.4 D-木糖添加量的影響

表11 D-木糖添加量對(duì)美拉德反應(yīng)的影響Table 11 Effect of additive amount of D-xylose on the Maillard reaction

由表11可知，當(dāng)D-木糖添加量小于1.5%時(shí)，隨著D-木糖添加量的上升，烤花生風(fēng)味越來(lái)越濃，異味逐漸消失；當(dāng)D-木糖添加量大于1.5%時(shí)，烤花生風(fēng)味逐漸變淡，焦糖味變重，所產(chǎn)生的風(fēng)味類似花生糖。綜合考慮，最適的D-木糖用量以花生粉質(zhì)量的1.5%為宜，其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值為1.6，其風(fēng)味較好的產(chǎn)物的吸光值大約在2.4～2.6范圍內(nèi)。

2.2.5 反應(yīng)溫度的影響

表12 反應(yīng)溫度對(duì)美拉德反應(yīng)的影響Table 12 Effect of reaction temperature on the Maillard reaction

由表12可知，當(dāng)美拉德反應(yīng)溫度低于110 ℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的上升，烤花生味越來(lái)越濃，油脂味微弱，協(xié)調(diào)性增加；當(dāng)美拉德反應(yīng)溫度高于110 ℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的上升，油脂味變得濃郁，且產(chǎn)生令人不愉快的異味。綜合考慮，最適的反應(yīng)溫度以110 ℃為宜，其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值為1.9，風(fēng)味較好的產(chǎn)物吸光值大約在1.6～1.8范圍內(nèi)。

2.2.6 反應(yīng)時(shí)間的影響

表13 反應(yīng)時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)的影響Table 13 Effect of reaction time on the Maillard reaction

由表13可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間低于90 min時(shí)，隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間的增加，烤花生味變得越來(lái)越濃郁；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于90 min時(shí)，隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間的增加，烤花生味變?nèi)酰視?huì)產(chǎn)生異味。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為120 min時(shí)，會(huì)產(chǎn)生良好的番茄味。綜合考慮，美拉德反應(yīng)的最適時(shí)間以90 min為宜。

3 結(jié)論與展望

本文通過(guò)酶聯(lián)美拉德反應(yīng)可獲得天然烤花生風(fēng)味物質(zhì)。花生酶解液的最佳制備條件為風(fēng)味蛋白酶和Lipase MER的比例為1∶1，酶濃度為0.3%，料液比為1∶3，酶解溫度和時(shí)間分別為50 ℃和7 h；美拉德反應(yīng)的最佳條件為谷氨酸和D-木糖的添加量分別為酶解液質(zhì)量的1.0%和1.5%，反應(yīng)溫度和時(shí)間為110 ℃和90 min，在此條件下得到的產(chǎn)物具有香濃的烤花生風(fēng)味。

在研究的過(guò)程中偶然發(fā)現(xiàn)，用1.0%的谷氨酸和1.5% D-木糖與花生酶解液在110 ℃的條件下進(jìn)行熱反應(yīng)120 min，所得樣品具有良好的番茄味。用1.0%的谷氨酸和2.0% D-木糖與花生酶解液在110 ℃的條件下熱反應(yīng)120 min，所得樣品具有良好的花生糖風(fēng)味。因此，接下來(lái)可對(duì)天然花生糖風(fēng)味物質(zhì)和番茄風(fēng)味物深入研究。此外，還可借助GC-MS、電子鼻、電子舌等現(xiàn)代高新實(shí)驗(yàn)設(shè)備對(duì)制得的各種風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)分析，為烤花生風(fēng)味物質(zhì)的配制提供了理論依據(jù)。