分散液液微萃取/氣相色譜-串聯質譜技術聯用快速測定醬油中糠醛類物質

周斌，楊坤

(1.杭州市食品藥品檢驗研究院，杭州 310022；2.黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556012)

糠醛類物質包括糠醛、5-甲基糠醛和5-羥甲基糠醛，是一組重要的呋喃結構化合物[1]，廣泛存在于各種食品中，例如面包、酒類、果醬、醋和醬油等[2-6]。糠醛類物質來源于食品加工中與糖相關的反應，如美拉德反應、酸性水解或焦糖化反應等[7-8]。含糖食物在熱處理或長期儲存過程中，糠醛和5-羥甲基糠醛含量顯著增加，導致食物的顏色、質地和風味發生變化[9]。因此，糠醛類物質被認為是多種食物新鮮度和質量的重要指標[10]。5-羥甲基糠醛還是一種能與人體蛋白結合產生的毒素，會刺激眼結膜，損害內臟[11-12]。目前我國食品安全國家標準 GB 2760-2014《食品添加劑使用標準》中，糠醛、5-甲基糠醛允許作為食品香料使用。目前國內外測定糠醛類物質的方法主要有數字圖像比色法[13]、示差分光光度法[14]、固相微萃取氣相色譜法[15]、頂空固相微萃取氣相色譜-質譜法[16-18]、高效液相色譜法[19-21]和同位素稀釋液相色譜-質譜法[22]。

分散液液微萃取技術是通過形成穩定的萃取劑/分散劑/樣品溶液乳濁液體系，使待測物在樣品溶液及萃取劑之間快速達到分配平衡而完成萃取。因其方法簡單易行、環境污染少、成本低、靈敏度高等優點，已應用于環境分析、食品中有害物質的分析[23]。本文將分散液液微萃取技術和氣相色譜-串聯質譜法結合測定醬油中糠醛類物質含量，對樣品的前處理方法及GC-MS/MS分析條件進行優化，通過對醬油中糠醛類物質進行分析，驗證了該方法的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準品：糠醛、5-甲基糠醛和5-羥甲基糠醛(百靈威科技有限公司，純度≥98%)；氯苯、三氯甲烷、四氯乙烯、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷(色譜純，美國 Thermo Fisher Scientific公司)；實驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

CP450-300MS GC-MS/MS 美國Bruker公司；高速離心機 上海Heal Force公司；Milli-Q 裝置 美國Millipore公司；ME802型電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

1.3.1.1 標準儲備液

將糠醛、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛用乙酸乙酯配制成質量濃度為2000 mg/L的標準儲備液，于4 ℃冰箱中保存。

1.3.1.2 標準工作液

吸取合適的儲備液，用三氯甲烷逐級稀釋成0.002，0.01，0.05，0.2，0.5，1，5，10 mg/L的標準工作液。以質量濃度(X)為橫坐標，離子峰面積(Y)為縱坐標，用外標法繪制標準工作曲線。

1.3.2 樣品前處理

稱取2 g試樣(精確至0.01 g)于20 mL刻度離心管中，加入10.0 mL乙腈，渦旋10 min。準確吸取1 mL乙腈提取溶液作為分散劑，于15 mL尖底塑料離心管中，加入5 mL水，渦旋混合后迅速加入100 μL三氯甲烷，渦旋3 min，6000 r/min離心5 min。用微量注射器抽取離心管底部的三氯甲烷，進行GC-MS/MS分析。

1.3.3 氣相色譜-串聯質譜方法

色譜柱：VF-WAXms(30 m×0.32 mm×1.0 μm)彈性石英毛細管柱；進樣口溫度230 ℃；柱升溫程序：初溫50 ℃保持0.5 min，以25 ℃/min的速率升溫至230 ℃保持6.5 min，共15 min；載氣：高純氦氣(99.999%)；柱流量1.0 mL/min；恒定流量模式；進樣量：1.0 μL。電子轟擊源(EI)；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；腔體溫度40 ℃；溶劑延時4.5 min；分段掃描；碰撞氣：氬氣，壓力為0.2 Pa(1.5 m Torr)。

3種物質的母離子、子離子和多反應監測(MRM)參數見表1。

表1 3種物質的定性及定量選擇離子和MRM參數Table 1 The qualitative and quantitative selection of ion and MRM parameters of the three furfurals

1.3.4 正交實驗

影響分散液液微萃取的因素有萃取劑體積、分散劑體積、水的體積、萃取時間等。本實驗通過對以上4個因素進行正交實驗，測定5-甲基糠醛的回收率的影響，確定最優萃取條件。影響萃取效率的各因素水平見表2。

表2 萃取實驗各因素水平Table 2 The factors and levels of three furfurals＇ extraction test

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

3種糠醛類化合物均屬于極性化合物，應采用極性低流失VF-WAXms色譜柱進行測定。分別進3種物質標準溶液，通過全掃描(Scan)模式，確定化合物的結構信息、保留時間。選擇峰強度最高的離子作為母離子，做進一步子離子掃描，分別選擇較高響應和干擾少的子離子作為定量和定性離子，對各子離子碰撞能量進行優化；3種糠醛類化合物的混合標準溶液總離子圖(TIC)見圖1，3種化合物峰形良好，響應較高，無雜質干擾。

圖1 3種糠醛類物質標準品總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of standard samples of three furfurals

2.2 提取溶劑的優化

使用不同溶劑對3種糠醛類化合物的提取效率差別比較大。糠醛類物質屬于極性物質，根據“相似相溶”原理，極性溶劑的提取效率較高。

由圖2可知，乙腈作為提取溶劑時，糠醛和5-甲基糠醛的回收率均大于85%，5-羥甲基糠醛的回收率為88.4%，明顯高于乙酸乙酯68.8%，二氯甲烷的66.7%和丙酮的66.2%。此外，乙腈作為提取溶劑時，不易提取油脂類物質，可以減少雜質干擾，故本次實驗采用乙腈作為提取溶劑。

圖2 使用不同提取溶劑時3種糠醛化合物的回收率Fig.2 The recovery rates of three furfurals under different extraction solvents

2.3 萃取溶劑的優化

萃取劑需滿足以下要求：萃取劑與水較小溶解能力，密度必須大于水以便萃取溶劑沉淀至底部；對目標化合物的溶解性好；能滿足后續色譜分析。常用的萃取劑有二氯甲烷、氯苯、三氯甲烷、四氯乙烯等。

圖3 萃取劑種類對回收率的影響 Fig.3 The effect of different types of extraction solvents on the recovery rates

由圖3可知，由于二氯甲烷易揮發，萃取液體積變化大，實驗結果的重現性較差；三氯甲烷的萃取回收率(88.8%～97.8%)比氯苯(84.6%～93.1%)和四氯乙烯(77.9%～92.1%)要好，四氯化碳在水中的溶解度較小，可以減少萃取劑損失，故選擇三氯甲烷為待測物的萃取溶劑。

2.4 萃取劑、分散劑、水的體積及萃取時間的選擇

以三氯甲烷為萃取劑，乙腈提取液為分散劑，通過正交實驗進行DLLME測定，以5-甲基糠醛含量計算回收率。

圖4 萃取劑、分散劑、水的體積及萃取時間對回收率的影響Fig.4 The effects of extractant volume,dispersant volume,water volume,extraction time on the recovery rates

由圖4中a可知，萃取劑三氯甲烷的體積大于100 μL時，回收率變化不大，因此選擇萃取劑的體積為100 μL。

由圖4中b可知，分散劑的體積為1.0 mL時萃取效率最高。原因可能是隨著分散劑體積增加，待測物在水中的分散程度增大，溶解度增加，使得萃取效率隨之降低。

由圖4中c可知，隨著水的體積的增加，5-甲基糠醛的回收率不斷上升；當水的用量大于5 mL時，萃取效率隨之下降。原因可能是水的用量過大時，較多萃取劑溶解在水中造成損失，導致萃取效率降低。因此，實驗選擇水的用量為5 mL。

由圖4中d可知，時間為1 min以后快速達到萃取平衡，最佳萃取時間為1 min。

2.5 標準曲線、線性范圍及檢出限

在經過優化的樣品前處理和GC-MS/MS分析條件下，3種糠醛的檢出限、定量限、線性回歸方程、相關系數、線性范圍結果見表3。3種糠醛在0.002～10 mg/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數R>0.999，檢出限LOD以定量離子3倍信噪比(S/N=3)計，定量限LOQ以S/N=10計，可滿足實際樣品的測定。

表3 3種糠醛物質的檢出限、定量限、線性方程、相關系數及線性范圍Table 3 The LODs,LOQs,regression equations,correlation coefficients and linear ranges of three furfurals

2.6 方法的添加回收率、精密度

取不含本底的醬油樣品5份，每份2.00 g，分別添加0.1，0.5，10.0 mg/kg 3個水平質量濃度的3種糠醛化合物的標準儲備液。按1.3.2的方法測定回收率，每個水平測定5次，結果見表4。

表4 3種糠醛類物質的添加回收率和精密度(n=5)Table 4 The recovery rates and precision of three furfurals (n=5)

結果顯示：在0.1，0.5，10.0 mg/kg 3個添加水平下，平均回收率為87.6%～100.2%，相對標準偏差(RSD)為2.1%～8.3%，滿足定量分析的要求。

2.7 實際樣品的測定

使用本方法對不同品種醬油中的糠醛、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛進行實際檢測。檢驗結果顯示：糠醛含量在0～1.1 mg/kg，5-羥甲基糠醛含量在0～7.8 mg/kg左右。這可能與食品加工過程中蛋白質與糖類發生美拉德反應產生糠醛物質有關；也與醬油的釀造發酵工藝產生糠醛類風味物質有關。

3 結論

本文將分散液液微萃取技術與氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)相結合應用于醬油中3種糠醛類物質的檢測，選擇性好，靈敏度高，操作簡單，沒有繁瑣的凈化和提取過程。目前常用的糠醛類物質含量的檢測方法主要有紫外分光光度法和高效液相色譜法，無法檢測到糠醛類化合物含量較低的食品。本方法的檢出限可達0.01 mg/kg，有更高的靈敏度，可以為醬油的加工工藝提供理論基礎，同時為研究監測醬油中美拉德反應產生的有毒有害物質含量提供了新的思路。