肉制品中雜環(huán)胺檢測與抑制的研究進(jìn)展

溫平平，夏超，于小番，許慧卿

(揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127)

Widmark[1]最先在高溫烤制的馬肉提取液中發(fā)現(xiàn)了可增加小鼠患癌率的物質(zhì)，到20世紀(jì)70年代，Sugimura等[2]在烤魚和烤牛肉中確定了致癌物雜環(huán)胺的存在，之后Commaner等[3]進(jìn)一步確定了雜環(huán)胺的種類，Gross等[4]提出用固相萃取對雜環(huán)胺進(jìn)行定量檢測的方法。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們對雜環(huán)胺的研究逐步深入，雜環(huán)胺對人體健康的影響也逐漸受到重視，近年來，專家們還發(fā)現(xiàn)雜環(huán)胺可以誘發(fā)機(jī)體突變、產(chǎn)生腫瘤，其毒性能力比黃曲霉毒素、苯并芘強(qiáng)百倍甚至上千倍，對人體健康造成極大威脅。

基于此，本文主要介紹了肉制品中雜環(huán)胺的檢測方法和抑制手段，雜環(huán)胺的檢測方法中高效液相色譜-質(zhì)譜法最為常用，其優(yōu)勢在于樣品處理簡單、操作自動化、分離速度快；雜環(huán)胺的抑制主要是從雜環(huán)胺的形成源頭以及體內(nèi)調(diào)控兩方面介紹，以期為雜環(huán)胺引起的健康問題提供基礎(chǔ)性的理論指導(dǎo)。

1 雜環(huán)胺的分類

目前已知的雜環(huán)胺有30多種，按結(jié)構(gòu)分為氨基咪唑氮雜環(huán)胺和氨基咔啉類雜環(huán)胺；按形成溫度不同分為熱反應(yīng)雜環(huán)胺(150～250 ℃)和熱解雜環(huán)胺(>250 ℃)；按化學(xué)性質(zhì)分為極性和非極性雜環(huán)胺(IQ型和非IQ型雜環(huán)胺)，其中非極性雜環(huán)胺的致癌、致突變性比極性雜環(huán)胺弱，詳情見表1。

表1 雜環(huán)胺分類表[5]Table 1 The classification table of heterocyclic amines

續(xù) 表

2 雜環(huán)胺的形成機(jī)制

2.1 熱反應(yīng)雜環(huán)胺的形成機(jī)制

熱反應(yīng)雜環(huán)胺的形成主要是通過Maillard反應(yīng)的中間過程和自由基途徑產(chǎn)生。喹啉和喹喔啉類雜環(huán)胺的形成途徑：一種是肉制品在高溫加熱過程中游離氨基酸和糖類發(fā)生脫水、環(huán)化形成乙烯基-吡啶/吡嗪，肌酸轉(zhuǎn)化成肌酸酐，二者同Strecker降解過程中生成的醛類發(fā)生醇醛縮合形成雜環(huán)胺[6]；另一種是由Kikugawa[7]、Kato等[8]在Pearson等[9]的研究基礎(chǔ)上得到的雜環(huán)胺自由基形成機(jī)制，即糖類與氨基酸在Maillard反應(yīng)未發(fā)生Amadori重排前，通過形成吡嗪、吡啶和碳中心自由基進(jìn)一步產(chǎn)生吡嗪、吡啶衍生物，最后同肌酸酐反應(yīng)形成雜環(huán)胺。PhIP的形成前體是苯丙氨酸和肌酸酐，苯丙氨酸為PhIP的吡啶部分提供碳原子，肌酸酐則形成PhIP的咪唑部分，其形成也是在Maillard反應(yīng)過程中完成的[10]。

2.2 熱解雜環(huán)胺的形成機(jī)制

熱解雜環(huán)胺多認(rèn)為是通過蛋白質(zhì)或氨基酸的高溫?zé)峤庑纬伞orharman和Harman的形成反應(yīng)類似,其前體都是葡萄糖和色氨酸。色氨酸在Amadori重排后通過脫水、β-消去反應(yīng)等形成氧鎓離子,氧鎓離子經(jīng)C-C鍵斷開后進(jìn)行分子間取代反應(yīng)生成雜環(huán)胺。

2.3 結(jié)合態(tài)雜環(huán)胺的形成

結(jié)合態(tài)雜環(huán)胺是蛋白質(zhì)與游離態(tài)雜環(huán)胺結(jié)合形成的加合物，其形成方式主要是蛋白質(zhì)或氨基酸中的羧基與游離態(tài)雜環(huán)胺中的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，最終形成二者的加合物，即結(jié)合態(tài)雜環(huán)胺。結(jié)合態(tài)雜環(huán)胺對人體健康的潛在威脅性在于它可通過人體內(nèi)的消化酶作用轉(zhuǎn)化為有害的游離態(tài)雜環(huán)胺[11]。

3 雜環(huán)胺的分析方法

3.1 樣品提取

雜環(huán)胺的提取方法有溶劑萃取、固相萃取、固相微萃取和超臨界流體萃取等。溶劑萃取法是利用雜環(huán)胺的溶解性進(jìn)行分離，如Charles等[12]使用甲醇作為溶劑的加壓加速溶劑萃取器萃取雜環(huán)胺，Holland等[13]建立了快速簡便的串聯(lián)溶劑固相萃取方法實現(xiàn)雜環(huán)胺分離；固相萃取法最早由Gross等提出，主要包括樣品堿化→硅藻土、藍(lán)棉等吸附劑及乙酸乙酯、二氯甲烷等有機(jī)試劑混合萃取→采用串聯(lián)的PRS(丙基磺酸)和C18固相萃取小柱作為陽離子交換劑對提取的雜環(huán)胺進(jìn)行純化分離3個階段。與溶劑萃取法相比，其優(yōu)勢在于溶劑消耗較低、可高效去除干擾物質(zhì)，是目前最常見的HAAs樣品前處理方法，如Zhang Yuan等[14]使用固-相萃取結(jié)合超高效超臨界流體色譜與串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用在7 min內(nèi)分離出肉制品中的雜環(huán)胺；固相微萃取是利用涂有固定相的熔融石英纖維涂層來吸附、富集待測組分的純化方法。其優(yōu)勢在于集待測樣的萃取、濃縮于一體，極大地加快了檢測和分析速率，且可以實現(xiàn)超痕量分析[15]，如Zhang Qianchun等[16]建立了SPME-HPLC方法測定牛、羊肉中的5種雜環(huán)胺，檢出限為0.10～0.15 ng/kg；超臨界流體萃取是采用超臨界流體作為萃取劑從樣品中萃取特定成分以實現(xiàn)樣品分離純化的萃取技術(shù)，F(xiàn)ernando等[17]基于超臨界流體萃取程序，通過毛細(xì)管電泳和熒光檢測法對肉類樣品中的6種非極性雜環(huán)胺進(jìn)行分析測定。

3.2 雜環(huán)胺的檢測

3.2.1 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)

GC-MS集氣相色譜的優(yōu)良分離性和質(zhì)譜法的高選擇性優(yōu)勢為一體，該方法檢測所需的樣品量少，檢出限可達(dá)到ng級別[18]，可用于檢測較低含量的雜環(huán)胺或基質(zhì)復(fù)雜的樣品中的雜環(huán)胺。Warzecha等[19]利用GC-MS檢測技術(shù)對10種肉樣進(jìn)行雜環(huán)胺檢測并測出IQ、MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx和PhIP 5種雜環(huán)胺，總含量為1.9～77.4 ng/g。其弊端為檢測前需衍生化處理待測樣且不能檢測熱不穩(wěn)定的化合物。

3.2.2 高效液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)

LC-MS不需要衍生化處理就可以對雜環(huán)胺進(jìn)行定性、定量分析，且具有分離速度快、操作自動化等優(yōu)勢，因此在雜環(huán)胺的檢測中被廣泛應(yīng)用。高效液相色譜可與熒光檢測器(FLD)、紫外檢測器(UV)、電化學(xué)檢測器(ED)和二極管陣列檢測器(DAD)等一個或多個檢測器聯(lián)用檢測。Barcelo等[20]采用超高效液相色譜實現(xiàn)2 min內(nèi)16種雜環(huán)胺的定性、定量檢測；徐琦等[21]建立超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法檢測了魚肉制品中的12種雜環(huán)胺，實現(xiàn)雜環(huán)胺檢測時的快速分離，其中檢出限為0.3～1.0 μg/kg。

3.2.3 酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)

ELISA是一種檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定技術(shù)，具有操作簡捷、檢測成本低等優(yōu)點(diǎn),尤其適合于復(fù)雜基質(zhì)中的微量成分分析[22]。Martin等[23]制備了PhIP的4種結(jié)構(gòu)類似物PhIP-1、PhIP-2、PhIP-3和PhIP-4的抗體,采用ELISA法研究了4種抗體之間的特異性和選擇性；Sheng Wei等[24]開發(fā)了一種直接競爭ELISA法測定肉樣中的IQ，檢出限為2.7～3.3 μg/kg。

3.2.4 熒光檢測法(FD)

FD是利用物質(zhì)的熒光特性對待測物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的方法。該方法具有價格便宜、檢出限低、靈敏度高等優(yōu)勢，但只能檢測具有熒光特性的物質(zhì)，具有一定局限性。De Andrés等[25]建立了熒光檢測法結(jié)合SFE-毛細(xì)管電泳對肉樣中6種非極性雜環(huán)胺進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其比一般的檢測方法更快且可以有效避免待測物質(zhì)中非熒光物質(zhì)的干擾。

4 雜環(huán)胺的抑制及其機(jī)制

雜環(huán)胺的產(chǎn)生在蛋白質(zhì)高溫加熱過程中是不可避免的，需要在不影響食物整體的感官品質(zhì)的基礎(chǔ)上將雜環(huán)胺的產(chǎn)生量降到最低或減弱其毒性，一方面可通過源頭干預(yù)控制雜環(huán)胺的生成，另一方面則可通過體內(nèi)調(diào)控來降低對人體的損害。

4.1 雜環(huán)胺的源頭控制

4.1.1 提高科學(xué)技術(shù)，改進(jìn)加工工藝

生產(chǎn)生活中可利用高新技術(shù)改進(jìn)食品加工工藝，抑制雜環(huán)胺的生成，如Feng Ruihong等[26]采用蒸汽輔助焙烤的方式抑制了牛排中雜環(huán)胺的產(chǎn)生(IQ、Norharman除外)，曾茂茂等[27]基于酰胺類活性成分研究發(fā)明了降低游離態(tài)和結(jié)合態(tài)雜環(huán)胺含量的方法。

4.1.2 添加外源物質(zhì)，清除自由基

雜環(huán)胺可通過自由基途徑產(chǎn)生，因此添加具有清除自由基作用的外源物質(zhì)一定程度上可以抑制雜環(huán)胺的生成。如Cheng Yiqun等[28]研究發(fā)現(xiàn)富含酚類化合物的甘蔗糖蜜提取物對炸雞中雜環(huán)胺的形成有抑制作用并猜測可能與自由基途徑有關(guān)；Keskekoglu等[29]研究葡萄籽提取物對4種不同加工技術(shù)的牛肉和雞肉丸中雜環(huán)胺形成的抑制效果，研究結(jié)果表明，添加葡萄籽提取物是降低牛肉和雞肉丸中雜環(huán)胺含量的重要因素且均與自由基清除能力有關(guān)。

4.1.3 抑制美拉德反應(yīng)

美拉德反應(yīng)在肉制品加熱過程中扮演著重要角色[30]，多項研究表明，雜環(huán)胺是通過美拉德反應(yīng)生成的，亞硫酸鈉和有機(jī)硫化合物可通過阻礙美拉德反應(yīng)的進(jìn)行降低雜環(huán)胺的生成量。大蒜作為一種日常調(diào)味品，它含有大量的有機(jī)硫化物[31]，Tsai等[32]將大蒜和洋蔥中天然存在的有機(jī)硫化合物注入豬肉中，發(fā)現(xiàn)可減少IQ、MeIQ等雜環(huán)胺的生成量;李利潔[33]在牛肉中加入槲皮素后檢測到了槲皮素-苯乙醛加合物并發(fā)現(xiàn)這種加合物的存在對PhIP的形成具有抑制作用，可能與干預(yù)美拉德反應(yīng)有關(guān)。

4.1.4 控制前體物的種類和數(shù)量

通過調(diào)整原料肉的加工方式使含前體物較多的肉汁液浸出以降低雜環(huán)胺的生成。如Felton等[34]用微波對牛肉進(jìn)行預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)雜環(huán)胺的生成量顯著降低。Hasnol等[35]發(fā)現(xiàn)，通過抑制前體物苯丙氨酸、色氨酸等的含量可以有效抑制PhIP、Harman和Norharman的生成。

4.2 雜環(huán)胺的體內(nèi)調(diào)控

雜環(huán)胺進(jìn)入人體后可通過膳食纖維的吸附作用降低人體對雜環(huán)胺的吸收率，如Persson等[36]研究碳水化合物對雜環(huán)胺形成的影響,發(fā)現(xiàn)馬鈴薯和麥麩纖維可逆結(jié)合PhIP，進(jìn)而抑制人體對雜環(huán)胺的消化吸收。經(jīng)吸附作用后殘余的雜環(huán)胺會隨血液運(yùn)送至肝臟,由CytP450依賴性單加氧酶催化生成N-OH-HAA化合物，進(jìn)而產(chǎn)生致癌性物質(zhì)，致癌活性物質(zhì)與人體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合形成加合物引起人體細(xì)胞損傷、生物活性功能喪失及致突變等問題[37]。因此可通過阻礙雜環(huán)胺加合物形成或?qū)⒁呀?jīng)形成的雜環(huán)胺加合物切除修復(fù)來抑制雜環(huán)胺對人體的危害。Reis等[38]發(fā)現(xiàn)某些益生菌可與HAAs結(jié)合，阻礙雜環(huán)胺加合物的生成，使雜環(huán)胺失活并隨益生菌通過糞便排出體外。Huber等[39]發(fā)現(xiàn)咖啡中的咖啡因可通過激活雜環(huán)胺解毒酶如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)來減少雜環(huán)胺加合物進(jìn)而抑制雜環(huán)胺的代謝。Ho等[40]認(rèn)為在雜環(huán)胺加合物已經(jīng)形成后可以通過基因修復(fù)，即切除基因中形成雜環(huán)胺加合物的部分以抑制雜環(huán)胺毒性作用的發(fā)生。

5 結(jié)語與展望

雜環(huán)胺主要存在于熱加工肉制品中，但由于食品體系較為復(fù)雜，形成的雜環(huán)胺種類多，質(zhì)量少，形成機(jī)制多樣，種種因素導(dǎo)致雜環(huán)胺的研究難度較高。盡管現(xiàn)在國內(nèi)外研究學(xué)者對雜環(huán)胺的研究范圍較廣，但具體性的研究較少，比如僅僅是研究某種加工方式或某種外源添加物對雜環(huán)胺的生成有抑制效果，但具體是通過何種途徑及如何抑制缺乏深入研究，再者，研究者們多針對游離態(tài)雜環(huán)胺的生成和抑制進(jìn)行研究，而結(jié)合態(tài)雜環(huán)胺作為存在于人體中的一個潛在風(fēng)險因素卻沒有得到更多的關(guān)注，因此，研究結(jié)合態(tài)雜環(huán)胺在人體內(nèi)的穩(wěn)定性和控制措施也具有重要的研究價值。