補腎強筋膠囊含藥血清對骨關節炎滑膜細胞、軟骨細胞PGE2、NGF基因表達的影響

陳 能，姚 楠

（1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院骨科，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫藥大學第二附屬醫院/廣東省中醫院珠海醫院骨科，廣東 珠海 519000；3.廣東省中醫藥工程技術研究院/廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東 廣州 510095）

膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種發生在膝關節的退行性疾病，病理表現為滑膜炎性增生，軟骨退變等，臨床表現為膝關節疼痛、活動受限等。既往已有多項動物及細胞實驗證實KOA的發生發展受多種細胞因子影響，其中基質金屬蛋白酶（Matrix Metallo Proteinase，MMP）在KOA關節軟骨的破壞中起主要作用；前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）是炎性致痛因子；環氧合酶-2（Cyclooxygenase，COX-2）是催化PG的合成的誘導酶，并參與了KOA炎癥反應；神經生長因子（Nerve Growth Factor，NGF）與神經病理性疼痛及炎性疼痛均有關［1-2］。本研究觀察補腎強筋膠囊含藥學清對KOA滑膜細胞、軟骨細胞MMP13、PGE2、COX-2、NGF基因表達的影響，探討治療KOA的作用機制［3］。

1 研究對象及分組

選取在廣東省第二中醫院骨科住院的擬行全膝關節置換手術的KOA患者。西醫診斷參照中華醫學會風濕病學分會2010年制定的膝關節骨性關節炎診斷標準［4］。

2 手術取材

術中取出病變滑膜組織，在完成股骨遠端截骨后取出股骨髁軟骨，軟骨厚度不小于1 mm，盡快轉移至實驗室。

3 實驗材料

主要實驗儀器：SmartSpec plus 核酸蛋白測定儀（Bio-Rad公司）；Varioskan Flash多功能酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司），IQTM5型RT-qPCR儀（Bio-Rad公司）。

藥物和試劑：補腎強筋膠囊（廣東省第二中醫院制劑室）；重組人IL-1β試劑（Peprotech公司）；First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo公司）；MaximaTM SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2×）（Thermo Fisher Scientific公司）；PCR特異性引物（上海英濰捷基貿易有限公司）。

4 實驗方法

原代滑膜細胞培養。滑膜組織剪切碎放入培養皿中，DPBS溶液清洗棄上清液后加0.25%胰酶1 mL，靜置于37℃，5%CO2培養箱60 min，取出棄胰酶，加入10%FBS的DMEM 2mL，然后靜置于37℃，5%CO2培養箱中培養。待細胞生長達瓶底90%以上后，用0.25%胰酶進行消化傳代，然后繼續用10%FBS的DMEM培養。

原代軟骨細胞培養。軟骨組織剪切成碎塊放入培養皿，DPBS溶液清洗棄上清液后加入0.25%胰酶1mL，靜置于37℃，5%CO2培養箱30min，然后棄上清液，加入0.02%II型膠原酶，靜置于37℃，5%CO2培養箱內過夜后，用100μm濾網過濾，加入10%FBS的DMEM，1600rpm離心5min，棄上清，細胞沉淀用10%FBS的DMEM培養，待細胞生長達瓶底90%以上后，用0.25%胰酶消化傳代，然后繼續用10%FBS的DMEM培養［5-7］。

含藥血清制備［5-7］。SPF級別SD雌性大鼠10只，體質量為180～220g。把大鼠分成空白組、含藥血清組，每組5只。根據動物與人之間藥物劑量換算，補腎強筋組每1kg予以0.243g生藥補腎強筋膠囊溶液灌胃，空白組予生理鹽水灌胃。所有大鼠連續7天每天灌胃1次，然后行腹主動脈取血，然后按3000rpm離心5min，棄上清液，56℃水浴30min滅活，經0.45μm濾膜抽濾，分裝，置于-80℃冰箱保存，即為空白血清和含藥血清。

細胞造模及分組［4］。將第3代細胞按每孔1×105個細胞密度種植于6孔板（n=6），培養至融合度約達80%時，棄培養基，用DPBS清洗后，進行分組處理。正常組為DMEM培養基+10%空白血清；OA組為DMEM培養基+10%空白血清，加入50ng/mL IL-1β；含藥血清組為DMEM培養基+10%含藥血清，加入50ng/mL IL-1β。連續培養24h后收集細胞。

RT-qPCR檢測細胞PGE2、COX-2、NGF、MMP-13的基因表達。首先采用Trigol、異丙醇和氯仿等試劑提取滑膜細胞、軟骨細胞總RNA。用First Strand cDNA Synthesis Kit提供的實驗方法進行反轉錄操作，加入上述提取的總RNA，合成First-Strand cDNA。基因引物設計利用Primer6.0生物軟件。然后在定量PCR儀進行擴增和熔解曲線分析，反應結束后記錄Ct值，運用2-△△Ct法分析各組基因相對表達量。

5 結 果

滑膜細胞基因表達比較。與OA組比較，正常組、含藥血清組PGE2、NGF、COX-2、MMP-13基因表達比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，含藥血清組PGE2、NGF、COX-2、MMP-13基因表達差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組滑膜細胞因子基因表達比較 （n=6，±s）

表1 各組滑膜細胞因子基因表達比較 （n=6，±s）

注：與OA組比較，*P＜0.05；與正常組比較，△P＜0.05。

組別 PGE2 NGF COX-2 MMP-13正常組 1.00±0.40*1.00±0.42*1.00±0.40*1.00±0.44*OA組 5.36±1.81 4.59±0.99 4.32±0.81 6.43±1.79含藥血清組2.42±0.39*△2.53±0.40*△2.36±0.56*△ 2.87±0.73*△

軟骨細胞基因表達比較。與OA組比較，正常組、含藥血清組PGE2、COX-2、、MMP-13基因表達比較差異均有統計學意義（P＜0.05），與正常組比較，含藥血清組PGE2、COX-2、、MMP-13基因表達比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。3組軟骨細胞NGF表達比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組軟骨細胞因子基因表達比較 （n=6，±s）

表2 各組軟骨細胞因子基因表達比較 （n=6，±s）

注：與OA組比較，*P＜0.05；與正常組比較，△P＜0.05。

組別 PGE2 NGF COX-2 MMP-13正常組 1.00±0.33*1.00±0.13 1.00±0.29*1.00±0.34*OA組 3.21±1.10 1.03±0.30 7.48±2.15 3.61±0.91含藥血清組1.56±0.33*△1.21±0.44 3.32±0.79*△2.06±0.53*△

6 討 論

正常狀態下，膝關節滑膜可產生滑液，滑液主要發揮潤滑關節腔及吞噬物質的作用，軟骨由軟骨細胞、纖維和細胞外基質構成，細胞外基質能保護軟骨細胞使其不與關節腔直接接觸。KOA發生時，關節滑膜發生炎癥反應，釋放出炎性介質、細胞因子等物質［8］，使膝關節腔內環境處于炎性狀態，導致軟骨細胞外基質持續性地發生降解，當達到一定程度時軟骨細胞暴露于炎性環境中，使軟骨細胞逐漸失去活性，甚至死亡，最終軟骨破損。此外，KOA關節腔內物質中不乏多種致痛因子，這些因子刺激神經感受器，引起了疼痛［9-10］。研究表明，KOA膝關節滑膜、軟骨中一些細胞因子水平的升高影響了病情，王培等［11］研究表明COX-2mRNA在膝關節骨性關節炎病變初期滑膜細胞中表達水平較高。StoppielloLA等［12］發現KOA患者膝關節滑膜中NGF的表達升高，且與疼痛相關，而PecchiE等［13］研究采用炎性因子刺激軟骨細胞時，也會使NGF表達升高。本研究使用重組人IL-1β刺激復制滑膜細胞和軟骨細胞OA模型，結果表明上述因子基因表達確實有不同程度的升高，這與以往研究結果相符。

KOA屬中醫“痹證”范疇。潘建科等［14］通過數據挖掘分析表明具有補腎、活血功效的中藥是治療KOA內服處方的主要成分。補腎強筋膠囊由補益肝腎、活血通絡中藥組成，既能補肝腎之不足以滋養筋骨，也能通局部之淤阻以順暢氣血，從而發揮緩解膝關節疼痛，改善關節活動功能的功效。研究表明，補腎強筋膠囊能有效改善膝關節滑液中IL-1β、TNF-α、PGE2水平以及血清PGE2水平［15］，補腎強筋膠囊含藥血清可顯著降低軟骨細胞上清液NO和PGE2水平，并顯著降低軟骨細胞COX-2、iNOS、MMP-1、MMP-13 mRNA表達［5］。研究對該藥治療KOA的作用機制進行了補充，結果表明補腎強筋膠囊含藥血清對滑膜細胞PGE2、COX-2、MMP-13、NGF基因表達，對軟骨細胞PGE2、COX-2、MMP-13基因表達均有一定程度調節作用，但對于軟骨細胞NGF基因表達無明顯調節作用。

因此，補腎強筋膠囊治療KOA的作用可能與調節滑膜細胞PGE2、COX-2、MMP-13、NGF以及軟骨細胞PGE2、COX-2、MMP-13的基因表達有關。對于滑膜細胞，研究使用重組人IL-1β刺激，可使NGF基因表達顯著升高，而采用含藥血清干預能使NGF基因表達顯著下調，但對于軟骨細胞，無論用采取何種干預方式對NGF基因表達均無明顯調節作用。研究表明，膝關節滑膜中神經分布更為密集，但關節軟骨無神經支配，由于NGF分布可能與神經分布有關，因此軟骨細胞NGF基因表達未發生顯著變化［16］。