骨肉瘤細胞中miR-215-5p和eIF2a靶向關系及臨床意義

張 哲，程漠松，莊 鶴，田曉東

(錦州市第二醫院，遼寧 錦州 121000)

骨肉瘤的形成涉及機體多種遺傳因子，包括DNA、RNA等分子遺傳改變。近年研究顯示骨肉瘤的發病率呈明顯的升高趨勢[1-3]。蛋白質合成是維持細胞穩態和腫瘤細胞增殖的關鍵步驟，在蛋白質翻譯過程中真核細胞翻譯起始因子常發生變化，對于調控下游的腫瘤性增殖起重要作用。真核細胞翻譯起始因子2a(Eukaryotic translation initiation factor 2a,eIF2a)參與其中，其對細胞增殖、腫瘤細胞遷移及上皮間質轉化均有重要價值[2]。eIF2a發揮作用過程中受多種因子的調控，微小RNA(microRNAs,miRNAs)是eIF2a上游調控的重要因子[4-7]，本研究經數據庫初篩和前期實驗的篩選，選擇可能與eIF2a有結合位點的miR-215-5p進行相關實驗研究。本實驗基于骨肉瘤細胞進行實驗設計，探討miR-215-5p與eIF2a的靶向關系，分析二者表達的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人骨肉瘤細胞系Saos2購于中國科學院上海細胞生物學研究所。TRIZOL、細胞培養基PRMI1640及胎牛血清購自美國Gibco公司，ECL顯色液購自美國Thermo公司，eIF2a購自蘇州睿瀛生物技術公司，GAPDH、DAB和二抗購自北京中杉金橋生物技術公司。RIPA裂解液、胰酶消化液、質粒提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購自武漢三鷹生物公司。Lipofetamine 2000和雙熒光素酶試劑盒購自美國Invitrogen公司。引物由上海吉瑪生物合成。酶標儀為Thermo公司生產的MK3。PCR儀為美國Bio Rad IQ5。

1.2 研究對象 選擇2018年1月至2020年12月在我院確診為骨肉瘤并行手術治療的患者38例作為觀察對象。病例納入標準：①均有術后病理診斷，且符合WHO中的標準；②首次發病并確診；③臨床隨訪資料完整。排除標準：①伴有其他器官惡性腫瘤；②家族遺傳性疾病；③術前行放、化療。患者中男20例，女18例，年齡5～78歲，平均(18.1±4.5)歲。留取術后腫瘤組織新鮮標本(-80 ℃保存)和石蠟包埋標本。研究經醫院倫委員會批準同意，符合《赫爾辛基宣言》中的要求，家屬簽定知情同意書。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養：人骨肉瘤細胞系Saos2應用10%胎牛血清、1%青霉素的RPMI1640培養基，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養，當細胞生長至80%時進行傳代，調整細胞濃度為5×105個/ml接種于12孔板中，每孔1 ml。構建質粒進行細胞轉染，建立陰性對照組、無關序列組、miR-21-5p mimic組、miR-21-5p inhibitor組。操作嚴格按說明書操作，減少污染及人為誤差。

1.3.2 雙熒光素酶報告基因實驗：應用雙熒光素酶報告基因實驗觀察miR-215-5p與eIF2a 3’UTR的結合情況。將含有eIF2a mRNA 3’UTR的野生型(pGL3-eIF2a-WT)和突變型(pGL3-eIF2a-MT)報告質粒，分別同miR-215-5p mimic、陰性對照組(NC)共轉染到細胞系Saos2中，4 h后換液，繼續培養48 h后觀察熒光素酶的活性。

1.3.3 miR-215-5p的檢測：應用實時熒光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR,qPCR)檢測miR-215-5p的表達。TRIZOL提取總RNA并進行驗證。miR-215-5p引物上游：5’-TCGTGTCGTAGTGTGACTGTGG-3’，下游：5’-GCCTGTATAGGACACGTACT-3’。U6為內參，引物上游：5’-GGCAGACGCGAAGATTAGC-3’，下游：5’-TTGGAACGCAAATTCCG-3’。應用逆轉錄試劑盒合成cDNA。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，31個循環后進行延伸。讀取Ct值，以2-ΔΔCt法表示結果。ΔΔCt=[Ct目的基因(未知樣品)-Ct對照(未知樣品)]-[Ct目的基因(校正樣品)-Ct對照(校正樣品)]。

1.3.4 Western blot實驗：應用Western blot法檢測eIF2a的表達。以GAPDH作為內參。依次行蛋白提取、濃度測定、變性、加樣、電泳、電轉及免疫雜交進行實驗后，取出膜加入發光液 3 min，顯影20 s。以目的蛋白與GAPDH的比值作為結果進行半定量分析，應用Image J分析完成。嚴格按實驗步驟操作，做好質控工作。

1.3.5 免疫組化實驗：組織常規行取材、脫水、石蠟包埋后，切取4 μm切片，應用免疫組化Envision 法檢測eIF2a的表達，DAB顯色，嚴格按實驗步驟操作，設陽性對照，做好質控工作，減少人為誤差。結果由病理醫師進行判讀，應用盲法，eIF2a的顯色部位是細胞質，以黃色-棕褐色為陽性。應用著色強度及陽性率的綜合評分法。著色強度：無著色為0分，弱為1分，中為2分，強為3分。陽性率：選擇熱點區進行觀察，共選擇5個400倍視野，以陽性率<5%為0分，5%～10%為1分，以11%～25%為2分，以26%～50%為3分，以>50%為4分。兩者相乘為最終評分，總分范圍0～12分。以≤5分為陰性，以>5分為陽性。計算陽性率。

2 結 果

2.1 數據庫檢索的結果 Target Scan數據庫顯示miR-215-5p與eIF2a具有可能結合的堿基序列。見圖1。

圖1 Target Scan數據庫檢索結果

2.2 eIF2a在不同組別細胞系中的表達 miR-215-5p mimic組中eIF2a的表達明顯低于陰性對照組和無關序列組，miR-215-5p inhibitor組中eIF2a的表達明顯高于陰性對照組和無關序列組。見圖2。

圖2 eIF2a在不同組別細胞系中的表達

2.3 雙熒光素酶報告基因實驗結果 雙熒光素酶報告基因實驗顯示miR-215-5p與eIF2a具有靶向關系。見圖3。

注:miR-215-5p mimic與eIF2a+WT比較，*P<0.05

2.4 骨肉瘤不同臨床病理特征中miR-215-5p表達量、eIF2a陽性情況比較 骨肉瘤中miR-215-5p表達范圍是1.2～3.4，平均2.3±0.3。eIF2a共20例陽性，陽性率為52.63%。由表1可見，miR-215-5p的表達量、eIF2a的陽性率在骨肉瘤不同腫瘤最大徑和病變級別中的比較差異有統計學意義(均P<0.05)。而在不同性別、年齡及周圍組織累犯中的差異無統計學意義(均P>0.05)。見表1(圖4)。

表1 骨肉瘤不同臨床病理特征中miR-215-5p表達量、eIF2a陽性情況比較

A：miR-215-5p表達的擴增曲線(PCR)；B：eIF2a在骨肉瘤中陽性表達(免疫組化,×200倍)

2.5 骨肉瘤中miR-215-5p與eIF2a表達的相關性分析 應用Spearman相關分析顯示骨肉瘤中miR-215-5p與eIF2a呈負相關性(r=-0.67,P=0.0146)。

3 討 論

骨肉瘤的發生與機體的遺傳物質改變有關，其中包括DNA、RNA和相關蛋白質的異常表達[8-10]。miRNAs是近年學者關注到的非編碼RNA，其主要是通過調控下游因子發揮生物學作用，其異常表達與腫瘤的進展相關[11-13]。本研究基于骨肉瘤細胞系及骨肉瘤術后的病變組織進行實驗研究，結果顯示miR-215-5p mimic組中eIF2a的表達明顯低于陰性對照組和無關序列組，miR-215-5p inhibitor組中eIF2a的表達明顯高于陰性對照組和無關序列組，雙熒光素酶報告基因實驗顯示miR-215-5p與eIF2a具有靶向關系，且經骨肉瘤組織中的相關分析得以進一步明確，提示miR-215-5p與eIF2a具有明確的靶向關系，miR-215-5p可能作為上游因子調控下游因子eIF2a的表達，參與eIF2a調控的細胞增殖、凋亡、遷移及上皮間質轉化的作用。研究顯示骨肉瘤中miR-215-5p的表達量、eIF2a的陽性率在不同腫瘤最大徑和臨床分期中差異有統計學意義，由于上述兩個指標均為腫瘤進展的重要指標，提示miR-215-5p低表達、eIF2a高表達參與腫瘤的進展過程。miR-215-5p對腫瘤的調控具有直接作用。有研究顯示miR-215-5p低表達時對腫瘤細胞增殖因子和凋亡相關因子有調節作用，認為miR-215-5p具有抑癌基因樣的生物學作用[14-17]。miR-215-5p對細胞增殖的調控與對細胞周期的作用有關[18]。miR-215-5p可能對調控G0/G1期有一定作用。有研究顯認為miR-215-5p異常表達使腫瘤細胞增殖的周期縮短，有效提高腫瘤細胞增殖的速度，其可能是通過靶因子EGFR發揮調控作用的[19]。抑制凋亡是miR-215-5p低表達時的經典作用，使細胞自身的程序性死亡細胞減少，腫瘤細胞具有“永生化”的特點。骨肉瘤病變的分級與預后直接相關，而病理學形態診斷中病變的分級常缺少客觀指標，即往認為Ki67等增殖指標可能有助于分級，但是其臨界值學者很難達成共識。本研究發現的miR-215-5p的表達與骨肉瘤病變的級別相關，提示miR-215-5p可能為臨床病理診斷中判斷病變分級提供客觀的參考指標。EIF2a作為miR-215-5p調控的下游因子，可以引起Cyclin D1的增殖，并通過ATF4等途徑調節MMPs的表達，從而增加了腫瘤細胞的侵襲能力。也有研究認為PERK是eIF2a的上游信號分子，共同調節VEGF發揮腫瘤的促血管生成的作用，進而促進腫瘤的進展[20]。但是關于miR-215-5p/eIF2a調控的具體通路及作用機制有待更多實驗證實。

總之，骨肉瘤細胞中miR-215-5p和eIF2a具有靶向關系，miR-215-5p與eIF2a的異常表達可能參與腫瘤的進展。