姜黃素逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇耐藥的機制研究

劉小平，王勁進(jìn)，王銘遠(yuǎn)，2，柒銘銘，肖彩艷

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院婦產(chǎn)科，株洲 412000，2.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，長沙 410008）

卵巢癌是全球女性最常見的婦科腫瘤之一，也是女性癌癥死亡的第五個常見原因［1］，超過70%的卵巢癌患者確診時即為晚期，死亡率居各類婦科腫瘤第二［2］。目前的治療手段主要是手術(shù)切除，術(shù)后輔以放化療等綜合治療，但化療藥物副作用大且易產(chǎn)生耐藥性已成為卵巢癌治療失敗的主要原因之一［3］。紫杉醇是卵巢癌的一線化療藥物［4］，研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞自噬，且自噬的激活可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇耐藥［5］。因此，尋找有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑已成為卵巢癌研究的熱點和難點。姜黃素（Curcumin）是從姜黃根莖中提取的天然疏水性多酚化合物［6］，具有豐富的藥理活性，尤其是抗腫瘤活性［7］。然而尚無文獻(xiàn)報導(dǎo)姜黃素是否可以通過抑制人卵巢癌細(xì)胞自噬從而逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥。本研究通過紫杉醇濃度梯度遞增法誘導(dǎo)構(gòu)建對紫杉醇耐藥的人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3/T，探討耐藥細(xì)胞的生物學(xué)特性。并揭示姜黃素可能通過抑制自噬來發(fā)揮逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞株 OVCAR3/T對紫杉醇的耐藥作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥品包括姜黃素粉末（索萊寶，純度95%），溶于二甲基亞砜（DMSO，索萊寶）中配置成50 mmol/L的母液；紫杉醇注射液（購自海南制藥公司，6 mg/mL）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，索萊寶）溶于DMSO中配置成50 mmol/L的母液；RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；10 %胎牛血清（BI公司）；青鏈霉素混合液（BI公司）；0.25 %胰蛋白酶（BI公司）；LC3兔抗人單克隆抗體（CST公司）；p62兔抗人單克隆抗體（CST公司）；β-actin兔抗人單克隆抗體（武漢谷歌生物公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體（碧云天）。

1.2 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)本實驗使用的人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院贈予；培養(yǎng)液為RPMI1640（含10% 進(jìn)口胎牛血清、1%青鏈霉素混合液），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 耐藥細(xì)胞株OVCAR3/T的建立OVCAR3/T為本實驗組采用紫杉醇濃度梯度遞增法誘導(dǎo)建立的卵巢癌耐藥細(xì)胞株［8］，能在含紫杉醇濃度為0.1μg/L的培養(yǎng)基中長期穩(wěn)定生長，并命名為OVCAR3/T。

1.4 MTT法檢測卵巢癌細(xì)胞生長活力取對數(shù)生長期的OVCAR3和OVCAR3/T細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，置于培養(yǎng)箱中24小時，用不同濃度的紫杉醇、姜黃素分別處理72小時。然后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔中加入50μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后向每個孔中添加150μL DMSO，避光震蕩15min，通過酶標(biāo)儀檢測每孔在490 nm波長處的吸光度，計算出紫杉醇對兩種細(xì)胞生存率的影響，姜黃素對耐藥細(xì)胞生存率的影響，使用prism軟件繪制MTT曲線。

1.5 平板克隆實驗檢測卵巢癌細(xì)胞集落形成能力取對數(shù)生長期的OVCAR3和OVCAR3/T細(xì)胞接種在24孔板中，置于培養(yǎng)箱中24小時，用不同濃度姜黃素分別處理7天。當(dāng)細(xì)胞密度至70～80%時，取出24孔板，棄去培養(yǎng)基，用10%福爾馬林固定3小時，每孔加1mL 0.1%結(jié)晶紫浸染1小時，浸染后用蒸餾水緩慢輕柔清洗，倒置在紙上干燥。放入酶標(biāo)儀中，選擇波長為550mm進(jìn)行定量，分析不同濃度姜黃素對耐藥細(xì)胞集落形成能力的影響，使用prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6 RT-qPCR法檢測兩種細(xì)胞中自噬相關(guān)基因的表達(dá)差異、姜黃素對耐藥細(xì)胞自噬相關(guān)基因的影響Trizol法提取OVCAR3和OVCAR3/T細(xì)胞總RNA，利用紫外分光光度計測試RNA純度和濃度，RT-qPCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄制備 cDNA，進(jìn)行PCR擴增。2-△△CT法計算mRNA的相對表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參。每個實驗組重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 各基因熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物長度

1.7 Western blot法檢測兩種細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)差異、姜黃素對耐藥細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響用RIPA細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞，BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入一抗（1：1000）并于 4°C孵育過夜。PBST洗3次，二抗（1：1000）37° C孵育2h，再次PBST洗3次，室溫封閉2h，用ECL增強化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法所有定量實驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)通過Prism進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OVCAR3/T的模型建立用不同濃度紫杉醇分別處理OVCAR3和OVCAR3/T細(xì)胞72h，卵巢癌細(xì)胞活力隨姜黃素濃度增高而下降（見圖1）。應(yīng)用SPSS軟件估算出紫杉醇對OVCAR3和OVCAR3/T的IC50值分別為0.477μg/L和3.279μg/L，根據(jù)公式耐藥指數(shù)（resistance index，RI）=耐藥株IC50/敏感株IC50，計算出RI為6.87（P<0.05）（表2）。

圖1 不同濃度紫杉醇處理OVCAR3和OVCAR3/T細(xì)胞

表2 OVCAR3和OVCAR3/T細(xì)胞的IC50濃度

2.2 OVCAR3/T的生物特性

2.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化在倒置相差顯微鏡下觀察，可見對照組OVCAR3細(xì)胞株貼壁良好，細(xì)胞呈梭形或多邊形，少量圓形，胞體透亮，狀態(tài)佳；而OVCAR3/T耐藥細(xì)胞株貼壁較差，細(xì)胞形狀不規(guī)則，圓形或橢圓形細(xì)胞增多，細(xì)胞折光性差，較暗，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多。

2.2.2 自噬相關(guān)基因和蛋白表達(dá)差異與OVCAR3相比，OVCAR3/T細(xì)胞中LC3表達(dá)增加，P62表達(dá)降低，無論在 mRNA水平還是蛋白表達(dá)水平OVCAR3/T細(xì)胞中自噬均增加（圖2）。

圖2 OVCAR3和OVCAR3/T細(xì)胞P62、LC3基因和蛋白表達(dá)水平

2.3 姜黃素使OVCAR3/T細(xì)胞活力下降用不同劑量的姜黃素處理OVCAR3/T細(xì)胞。結(jié)果表明，與空白對照組相比，卵巢癌細(xì)胞活力隨姜黃素濃度增高、時間延長而下降（圖3），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 姜黃素抑制OVCAR3/T細(xì)胞集落形成能力使用Colony實驗檢測OVCAR3/T細(xì)胞的集落形成能力。與空白對照組相比，姜黃素處理后細(xì)胞的集落形成能力明顯下降（圖4）。結(jié)果表明，姜黃素可抑制人卵巢癌耐藥細(xì)胞株的集落形成能力。

2.5 姜黃素可抑制OVCAR3/T細(xì)胞自噬RT-qPCR檢測LC3、P62 mRNA表達(dá)，Western blot 檢測LC3、P62蛋白表達(dá)。與空白對照組相比，姜黃素處理后的OVCAR3/T細(xì)胞，LC3 mRNA和蛋白表達(dá)量增加，P62 mRNA和蛋白表達(dá)量下降（圖5）。結(jié)果表明，姜黃素可以抑制耐藥株中自噬的表達(dá)。

2.6 姜黃素作用于耐藥株使其對紫杉醇重新敏感用低濃度姜黃素（1μM）、紫杉醇（0.1μg/L）及姜黃素+紫杉醇分別作用于耐藥株24h，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥顯著降低細(xì)胞活力（圖6）。

圖6 姜黃素、紫杉醇單藥及聯(lián)合用藥作用于耐藥細(xì)胞

3 討論

腫瘤化療耐藥一直是癌癥治療中的難點，大量研究表明腫瘤化療耐藥與自噬相關(guān)［9］。研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇耐藥與多藥耐藥蛋白［10］、微管蛋白［11］及細(xì)胞凋亡［12］等有關(guān)。然而，紫杉醇耐藥機制繁冗復(fù)雜，其分子機制還不十分清楚。

自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有兩面性［13］，在腫瘤形成初期，自噬通過降解受損細(xì)胞器以修復(fù)變異細(xì)胞，此時自噬具有腫瘤抑制作用［14］；在饑餓、低氧等應(yīng)激情況下，自噬使?fàn)I養(yǎng)缺乏的腫瘤細(xì)胞通過降解部分自身物質(zhì)以滿足維持生存所需，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活，即保護(hù)性自噬［15］。研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬，并且紫杉醇誘導(dǎo)的自噬激活對卵巢癌細(xì)胞起到保護(hù)作用，是其產(chǎn)生耐藥的原因之一［5］。在多種腫瘤中也發(fā)現(xiàn)，自噬高表達(dá)與化療耐藥［16］、不良預(yù)后［17］顯著相關(guān)。而姜黃素是廣譜抗癌藥物，已有研究表明姜黃素可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞化療耐藥［18］，但其具體機制仍有待進(jìn)一步研究。因此，本研究就姜黃素在耐藥細(xì)胞株OVCAR3/T中的作用及具體機制進(jìn)行研究。

本研究成功建立對紫杉醇耐藥的人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3/T。相比于敏感細(xì)胞，耐藥細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，自噬表達(dá)增加。本實驗結(jié)果表明姜黃素呈時間、濃度梯度依賴性抑制耐藥細(xì)胞生長，姜黃素處理后的耐藥細(xì)胞自噬表達(dá)呈劑量依賴性降低，并且我們發(fā)現(xiàn)無毒劑量姜黃素作用于耐藥細(xì)胞后使其對紫杉醇重新敏感。 綜上，姜黃素抑制耐藥株OVCAR3/T的生長和增殖，逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇耐藥，其機制可能與抑制自噬的表達(dá)有關(guān)。姜黃素有望成為有效的逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的抗腫瘤藥物。