肺復康方對肺癌癌因性疲乏裸鼠骨骼肌的影響

許雙潔 ，杜肖琳，王云啟

（1.湖南中醫藥大學，長沙 410006；2.湖南省腫瘤醫院中醫/中西醫結合科，長沙 410013）

肺癌作為常見的惡性腫瘤，因其高發病率成為全球的“噩夢”［1］。在我國惡性腫瘤患者中，肺癌更是成為了頭號死亡原因［2］。癌因性疲乏（Cancer-related Fatigue，CRF）作為惡性腫瘤中常見的并發癥，成為近些年醫學研究的熱點［3］。董亞娜［4］等的臨床研究指出：肺癌中CRF發生率高達76.67%，CRF的發生嚴重影響了肺癌患者的生存質量。最新的NCCN CRF指南（2018版）定義CRF為：一種與惡性腫瘤或其治療相關的痛苦的、長時間的、主觀的、有關軀體、情感或認知方面的疲乏感，與近期活動量不符，并且影響正常生活［3］。何源源［5］等研究表明：CRF可以導致大鼠血漿中ATP水平降低，骨骼肌分裂增強，融合減弱，丙二醛合成增多和谷胱甘肽合成減少。本課題組對肺復康方的前期研究證明：肺復康方可通過提高IL-6水平、降低IL-1β和TNF-α水平，改善lewis肺癌小鼠炎癥因子失調狀態，有效緩解疲乏癥狀［6］。本實驗以前期研究為基礎，進一步探究肺復康方對肺癌CRF裸鼠骨骼肌的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用動物和細胞株SPF級雄性BALB/c裸鼠25只（4周齡，重量在18～22g之間），購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物質量合格證SCXK（湘）2019-0004。lewis肺癌細胞株（貨號ZQ0203），購于中喬新舟廠家。

1.1.2 主要試劑及儀器實驗試劑：肺復康方組方：百合 10g、赤芍 15g、丹參 15g、麥冬 10g、桑白皮 15g、瓜殼 10g、黃芩 10g、蚤休 10g、半枝連 15g、臭牡丹 10g、黃芪 20g、白術 10g、陳皮10g、谷麥芽各 10g、炮姜 10g、藿香 10g、神曲 10g。以上中藥顆粒劑均購于湖南省腫瘤醫院中藥房。細胞培養所需試劑：DEME basic（1X）高糖（貨號C11995500BT）、胰酶消化液（貨號25200056）、青鏈霉素（貨號15140122）以上均購于Gibco公司；胎牛血清（貨號04-001-1ACS），購于BI公司；磷酸鹽緩沖液（貨號；SH3025601），購于hyclone公司。BCA試劑盒（貨號HG-WDP0003a），購于HonorGene公司；ATP試劑盒（貨號A095-1-1）、GSH試劑盒（A006-2-1）、MDA試劑盒（A003-1-2），以上均購于南京建成生物工程研究所。Drp1抗體（貨號ab184247），購于英國abcam公司，Mfn1抗體（貨號13798-1-AP）和β-actin抗體（貨號66009-1-Ig）購于美國Proteintech公司。

實驗儀器：HR1500-IIA2型生物安全柜、DW-86L728型醫用超低溫保存箱、BCD-269WDGG型冰箱（青島海爾電器有限公司）；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；CKX41型光學倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；5702R型低速冷凍離心機（EPPendorf公司）；3111型二氧化碳培養箱（Thermo公司）；TS-1型搖床（其林貝爾公司）；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D型轉膜儀（中國北京六一公司）；GL-88B型旋渦混合器（其林貝爾公司）；JB-13型磁力攪拌器和PHS-3C型精密PH計（中國雷磁公司）；BioPreP-24型生物樣品均質儀（中國杭州奧盛公司）；自制小鼠鼠尾懸掛板。

1.2 實驗方法及檢測指標

1.2.1 Lewis肺癌細胞培養將Lewis肺癌細胞株放入水浴鍋復蘇，后置于含10%胎牛血清的DEME培養基中，在37℃，5%CO2，相對濕度95%的CO2培養箱中培養。隔天換液，2～3d 傳代。

1.2.2 分組25只裸鼠隨機分為5組，分別為空白對照組，模型組，劑量組（肺復康方低劑量組、肺復康方中劑量組、肺復康方高劑量組）。同組裸鼠同盒飼養，自由飲食，飼養環境安靜。

1.2.3 建立肺癌CRF裸鼠模型將培養好的Lewis肺癌細胞用PBS溶液稀釋成1×107/mL細胞濃度，按照每只裸鼠0.2mL的量接種于模型組及劑量組裸鼠右側腋窩皮下。

1.2.4 疲乏狀態判定建模后第3周利用鼠尾懸掛實驗明確各組裸鼠疲乏程度，判斷癌因性疲乏模型是否成功建立。將裸鼠尾巴末端2cm處固定在木板，使其呈倒掛狀態，頭部距離地面約15cm，左右兩側用擋板隔離裸鼠視線，裸鼠為克服異常體位而掙扎活動，力量耗竭后靜止不動呈失望狀態，計算每只裸鼠6min內不動時間，并同時觀察其掙扎幅度。

1.2.5 藥物干預及疲乏程度監測根據人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表，將肺復康方中藥顆粒劑配制為13g/kg（肺復康方低劑量組）、26g/kg（肺復康方中劑量組）和52g/kg（肺復康方高劑量組）。建模后第4周開始藥物干預，劑量組每只裸鼠每天給予0.4mL相應劑量的中藥干預，早晚各給藥1次，每周間隔給藥5天，休息2天，共藥物干預3周。模型組和空白對照組給予相同劑量生理鹽水干預。藥物干預的同時通過鼠尾懸掛實驗（2次/周）判斷各組裸鼠疲乏程度，動態監測劑量組疲乏緩解情況。

1.2.6 裸鼠處死與取材藥物干預3周后，用頸椎脫臼法處死裸鼠，解剖分離出后肢腓腸肌，置于冰塊中保鮮備用。實驗過程中，模型組以及中、高劑量組均有1～2只不同數量裸鼠死亡，為保證實驗科學性和嚴謹性，現取每組別3只樣本量。

1.2.7 裸鼠骨骼肌相關檢測WB法檢測骨骼肌內Drp1和Mfn1蛋白含量。剪取0.025g組織，預冷PBS洗組織，加入250μL RIPA裂解液研磨，裂解10min，離心，提取蛋白，配制10%分離膠，灌膠，用異丙醇封膠。待凝膠，配制4.8%的濃縮膠，灌膠，取160μL蛋白上清，加入40μL 5×loading buffer混勻，沸水煮5min，速冷備用。上樣10μL已變性蛋白，恒定電壓75V、時間為130min開始電泳，分別切膠Drp1（83KD），Mfn1（86KD），β-actin（42KD），給予 300 mA 持續電流轉膜，Drp1、Mfn1約100min，β-actin 約60min，配制5%脫脂奶粉封閉，一抗、二抗孵育，ECL化學發光液與膜孵育1min顯色，暗盒內與X膠片曝光5～20分鐘，顯影沖洗。

ELISA法檢測骨骼肌內ATP、MDA、GSH水平：研磨組織，提取骨骼肌內ATP，根據ATP、MDA和GSH測試盒說明書進行操作，然后根據線粒體蛋白濃度進行換算，得出各組骨骼肌中ATP、 MDA 和 GSH 的濃度。

1.3 統計學分析應用SPSS Statistics 25.0軟件包進行統計學分析。計量數據采用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD或S-N-K檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義，P<0.01為差異具有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 肺復康方對裸鼠行為學的影響建模后第3周對各組裸鼠進行鼠尾懸掛實驗，實驗數據顯示，與對照組裸鼠相比，模型組及劑量組失望時間均延長，差異具有統計學意義（P<0.05），提示癌因性疲乏模型建立成功。見表1。

表1 藥物干預前各組裸鼠失望時間表

藥物干預時對各組裸鼠進行鼠尾懸掛實驗判斷其疲乏情況。實驗數據顯示：各時間點模型組和各劑量組失望時間均長于空白組（P<0.05），藥物干預d3-d14各劑量干預組裸鼠失望時間與模型組比較無顯著性差異（P>0.05）；藥物干預后，高劑量組d10、所有劑量組d17、d21裸鼠失望時間明顯短于模型組（P<0.05）。結果見表2。

表2 干預時各組裸鼠失望時間表

2.2 肺復康方對裸鼠骨骼肌內相關蛋白的影響應用蛋白印跡法檢測各組裸鼠骨骼肌內蛋白表達情況，電泳圖顯示：Drp1蛋白表達：空白組<高劑量組<中劑量組<低劑量組<模型組。Mfn1蛋白表達：空白組>高劑量組>中劑量組>低劑量組>模型組（見圖1）。

圖1 各組骨骼肌蛋白Drp1、Mfn1蛋白印跡

與對照組相比，模型組及劑量組骨骼肌內Drp1數值均升高，差異具有顯著統計學意義（P<0.01）；與模型組相比，中、高劑量組骨骼肌內ATP數值均明顯下降，差異具有統計學意義（P<0.05），低劑量組 Drp1數值雖下降，但差異不具有統計學意義，考慮藥物劑量過低，藥效不明顯所致；劑量組組內對比，Drp1含量分別是低劑量組>中劑量組>高劑量組，低劑量組和高劑量組差異具有統計學意義（P<0.05），低劑量組和中劑量組、中劑量組和高劑量組差異不具有統計學意義（P>0.05）。

與對照組相比，模型組及劑量組骨骼肌內Mfn1數值均下降，差異具有顯著統計學意義（P<0.01）；與模型組相比，中、高劑量組骨骼肌內Mfn1數值均明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.05），低劑量組 Drp1數值雖升高，但差異不具有統計學意義，考慮藥物劑量過低，藥效不明顯所致；劑量組組內對比，Mfn1含量分別是低劑量組<中劑量組<高劑量組，低劑量組和高劑量組差異具有統計學意義（P<0.05），低劑量組和中劑量組、中劑量組和高劑量組差異不具有統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 肺復康方對各組裸鼠骨骼肌內蛋白的作用

2.3 肺復康方對裸鼠骨骼肌內ATP、GSH、MDA的影響與對照組相比，模型組及劑量組骨骼肌內ATP數值均下降，差異具有顯著統計學意義（P<0.01）；與模型組相比，劑量組骨骼肌內ATP數值均明顯升高，差異具有顯著統計學意義（P<0.01）；劑量組內對比，ATP含量分別是低劑量組<中劑量組<高劑量組，任意兩組之間差異具有顯著統計學意義（P<0.01），見表4。

與對照組相比，模型組及劑量組骨骼肌內MDA數值均升高、GSH數值均下降，差異具有統計學意義（P<0.05）；與模型組相比，劑量組骨骼肌內MDA數值均下降，差異具有統計學意義（P<0.05），高、中劑量組骨骼肌內GSH數值均升高，差異具有統計學意義（P<0.05），低劑量組GSH數值雖升高，但差異不具有統計學意義（P>0.05），考慮藥物劑量過低，藥效不明顯所致；劑量組內對比：MDA數值分布為低劑量組>中劑量組>高劑量組，低劑量組與中劑量組差異具有統計學意義（P<0.05），中劑量組與高劑量組差異不具統計學意義（P>0.05），考慮劑量過高，肺復康方藥物毒副作用所致。GSH數值分布為低劑量組<中劑量組<高劑量組，低劑量組和高劑量組之間差異具有統計學意義（P<0.05），低劑量組和中劑量組、中劑量組和高劑量組組間差異均不具有統計學意義（P>0.05），見表4。

表4 肺復康方對各組裸鼠骨骼肌內ATP、GSH、MDA的影響

3 討論

研究表明，CRF發病率逐年攀升［7］，接受手術、化療、放療等相關治療的惡性腫瘤患者普遍存在疲乏癥狀，CRF可發生在惡性腫瘤發生發展的任一過程，嚴重影響了患者的生存質量［8-9］。現代醫學對CRF的治療分為藥物干預和非藥物干預兩部分。藥物干預包括精神興奮劑、促紅細胞素（EPO）以及皮質類固醇激素等［10］。非藥物干預包括體能鍛煉、心理指導、光療、營養支持等［11-13］。中醫藥在CRF的治療方面發揮了重要作用，其方式多樣，療效顯著，中藥湯劑、針灸、穴位貼敷、中藥足浴等方式在臨床實踐中取得了良好的效果［14-17］。肺復康方是我院名中醫王云啟主任醫師總結的經驗方，本課題組通過長期臨床觀察發現肺復康方能夠有效改善肺癌CRF癥狀。

線粒體是機體進行有氧呼吸、制造能量的細胞器，其主要作用是為細胞的各種生命活動提供能量，保持線粒體融合與分裂的動態平衡是其正常功能的重要前提，這種動態平衡一旦因某些因素被打破，機體會因線粒體功能失常而處于疾病狀態［5］。本實驗研究得出，與空白對照組相比，劑量組及模型組均出現Mfn1表達減弱、Drp1表達增強，表明CRF裸鼠骨骼肌內線粒體分裂增強，融合減弱，氧化損傷的線粒體數量增多，導致供能減少，呈現疲乏狀態。劑量組內Mfn1含量高于模型組，Drp1含量低于模型組，表示肺復康方可上調Mfn1表達，下調Drp1表達，促進線粒體融合，減少其氧化損傷，保證持續為機體供能

線粒體同時也是ATP合成的重要場所，ATP是生物體內最直接的能量來源，當線粒體功能受損，ATP合成障礙，生物體會呈現疲乏狀態。MDA是由機體內自由基和某些脂質發生過氧化反應產生，是機體氧化損傷的標志［18］；GSH是機體抗氧化功能的指標，其參加參與了脂質過氧化物的清除［19］。當機體骨骼肌內MDA含量增多，GSH含量下降，則提示骨骼肌處于氧化損傷、供能障礙狀態，能量來源不足，機體表現出疲乏無力癥狀。本實驗結果表明，MDA、ATP含量：模型組<劑量組<空白對照組，GSH含量：空白對照組<劑量組<模型組。提示CRF裸鼠體內MDA、ATP含量減少，GSH含量增多，肺復康方能夠通過增加MDA、ATP含量，減低GSH含量來緩解CRF癥狀。

本實驗在前期研究的基礎上，通過建立肺癌CRF裸鼠模型，肺復康方中藥干預，測定裸鼠骨骼肌內Mfn1、Drp1蛋白含量及ATP、MDA、GSH含量，探究肺復康方對肺癌CRF裸鼠骨骼肌的干預機制。綜上可得結論：肺復康方能夠有效緩解CRF癥狀，其機制可能與興奮HPA軸，促進CORT分泌、抑制ACTH合成，促進骨骼肌融合，抑制其分裂，減少其氧化損傷有關。