TGF-β、內質網應激cross-talk在肺癌細胞上皮間質轉化 機制中的作用

王 濤，高 峰，王 瑞，米麗麗，張澤峰

（河北醫科大學第四醫院胸一科，石家莊 050000）

肺癌是常見惡性腫瘤，具有較高的發病率和死亡率，近年來肺癌發病呈逐年增長趨勢，早預防、早發現、早治療是控制肺癌進展關鍵［1］。由于肺癌早期癥狀不典型，引起肺癌早期診斷困難，導致部分患者確診時已是肺癌中晚期，甚至出現遠處轉移，嚴重增加臨床治療難度和影響患者臨床預后［2］。肺癌的轉移、復發與上皮細胞間質化（EMT）存在密切關系，EMT是指在某些特定的情況下上皮細胞的生理、病理狀態以及細胞形態向間充質細胞轉化，細胞間的附著能力減弱，更容易轉移［3］。轉移生長因子β（TGF-β）家族是一類具有旁分泌和自分泌功能的細胞因子，具有5類亞型并參與細胞多種生理功能。TGF-β1可廣泛分布于細胞、組織器官中，已有研究［4-5］表明口腔鱗狀細胞癌組織中心和浸潤前沿均呈高表達，與腫瘤浸潤深度和神經侵犯呈正相關，還能促進宮頸癌細胞的侵襲和遷移，體外細胞實驗［6-8］表明TGF-β1還能誘導乳腺癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞EMT。腫瘤細胞EMT發生受到多種因素的影響，有研究表明［9］內質網應激（ER stress）可以參與腫瘤進展，誘導腫瘤細胞EMT、自噬，增強腫瘤細胞侵襲和耐藥。但有關TGF-β1、ER stress在肺癌EMT之間cross-talk的研究報道較少，本研究旨在探討TGF-β1和ER stress在肺癌細胞EMT中的cross-talk，希望為臨床肺癌藥物研發提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 實驗材料肺癌A549細胞系購自上海邦景實業有限公司。TGF-β1（純度>90%）購自南京歐凱生物。4-PBA（純度>98%）購自美國MedChemExpress LLC。絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）抗體購自武漢益普生物科技有限公司。兔抗人磷酸化絲氨酸蘇氨酸激酶（p-AKT）、葡萄糖調節蛋白78（GRP78）、X盒集合蛋白1s（XBP-1s 1s）抗體購自上海科敏生物科技有限公司。ECL Kit購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco BRL。HRP標記羊抗兔二抗IgG、Trizol總RNA提取試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司。Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit購自上海翊圣生物科技有限公司。SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自上海滬震實業有限公司。Lightcycle 480實時定量PCR儀購自羅氏診斷。CO2培養箱購自美國REVCO。高速冷凍離心機購自美國Beckman Coulter。熒光顯微鏡購自德國徠卡。所用引物均有上海·生工提供。

1.2 細胞培養肺癌A549細胞置于PRMI 1640培養液（10%胎牛血清、100U/L青霉素和100mg/L鏈霉素）37℃、5%CO2飽和濕度恒溫孵箱中培養，培養至對數期，然后以1：4進行傳代培養，取第3代細胞用于后續實驗。

1.3 細胞分組和處理將肺癌A549細胞接種至滅菌培養皿中，培養條件同1.2，待生長至60%時加入不同濃度的TGF-β1（0、2.5、5、10 ng/mL）［10］處理，繼續孵育24 h，在顯微鏡下觀察細胞形態變化，細胞形態拉長且細胞間連接變得疏松說明細胞發生EMT。將肺癌A549細胞分為對照組、TGF-β1組、4-PBA組、聯合組，培養條件同上，待生長至60%時，待生長至60%時，TGF-β1組、4-PBA組、聯合組分別給予TGF-β1、4-PBA、TGF-β1+4-PBA處理，使其最終濃度分別為TGF-β1 10 ng/mL、4-PBA 10 mM、TGF-β1 10 ng/mL+4-PBA 10 mM，對照組給予等體積DMSO處理，繼續孵育24 h，用于后續實驗檢測。

1.4 transwell實驗將60μL Mateigel加入300μL無血清培養基混合均勻，加入100μL至上室膜包被，37℃孵育4 h，然后將1.3中對照組、TGF-β1組、4-PBA組、聯合組中的細胞接種至上室小孔（4×104/孔），下室加入600μL 含10%FBS培養基，作為趨化因子，1.2孵育條件繼續孵育24 h，棉簽擦除膜表層細胞，%甲醇固定底層細胞，%結晶紫染色20 min，高倍鏡下觀察5個不重疊視野，統計穿膜細胞數目，求其均值作為該組結果。實驗重復3次。

1.5 Western-blot檢測蛋白表達提取1.3中對照組、TGF-β1組、4-PBA組、聯合組細胞總蛋白，Bradford調整各組提取蛋白濃度一致，經SDS-PAGE凝膠電泳、電轉膜至PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人GRP78、XBP-1s、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K、GAPDH抗體（1∶500）4℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標記二抗（1：500）孵育1 h，TBST漂洗40 min，曝光顯影，系統自帶軟件分析蛋白相對灰度值。實驗重復3次。

1.6 RT-PCR檢測基因水平取1.3中對照組、TGF-β1組、4-PBA組、聯合組細胞，采用RNA純化試劑盒提取細胞總RNA，并反轉錄合成cDNA作為PCR擴增模板，擴增程序設置為95℃預變形3min、95℃變性10s、56℃退火30s、72℃延伸10 s，34個循環，選用U6作為看家基因，使用2－ΔΔCt［11］法分析基因相對水平。重復3次。

1.7 統計分析數據統計分析軟件使用SPSS 22.0，柱狀圖繪制軟件采用GraphPad Prism 6.0，數據表示為平均值±標準差，組間比較采用t檢驗，P<0.05表示存在統計差異。

2 結果

2.1 TGF-β1對肺癌A549細胞EMT的影響 TGF-β1處理下的肺癌A549細胞EMT形狀發生梭狀變化、細胞松散分布，隨著TGF-β1作用濃度升高，細胞散亂分布情況越明顯（圖1）。

圖1 各組細胞EMT情況

2.2 TGF-β1對肺癌A549細胞侵襲的影響 與對照組相比，TGF-β1組細胞侵襲數目升高（P<0.05），4-PBA組細胞侵襲數目降低（P<0.05）；與TGF-β1組相比，聯合組細胞侵襲數目降低（P<0.05）（圖2）。

圖2 各組細胞侵襲情況

2.3 各組細胞EMT相關基因水平比較與對照組相比，TGF-β1組N-cadherin、vimentin、Snail1和Snail2 mRNA水平升高（P<0.05），E-cadherin mRNA水平降低（P<0.05）；與對照組相比，4-PBA組N-cadherin、vimentin、Snail1和Snail2 mRNA水平降低（P<0.05），E-cadherin mRNA水平升高（P<0.05）；與TGF-β1組相比，聯合組N-cadherin、vimentin、Snail1和Snail2 mRNA水平降低（P<0.05），E-cadherin mRNA水平升高（P<0.05）（表1）。

表1 各組細胞EMT相關基因mRNA水平比較

2.4 各組細胞ER stress相關基因蛋白水平比較與對照組相比，TGF-β1組GRP78、XBP-1s蛋白水平升高（P<0.05），GRP78、XBP-1s mRNA水平升高（P<0.05）。與對照組相比，4-PBA組GRP78、XBP-1s蛋白水平降低（P<0.05），GRP78、XBP-1s mRNA水平降低（P<0.05）；與TGF-β1組相比，聯合組GRP78、XBP-1s蛋白水平降低（P<0.05），GRP78、XBP-1s mRNA水平降低（P<0.05）（圖3、表2）。

圖3 各組細胞GRP78、XBP-1s蛋白表達

表2 各組細胞ER stress相關基因蛋白水平比較（n=3）

2.5 各組細胞PI3K/AKT途徑相關蛋白水平與對照組相比，TGF-β1組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白水平升高（P<0.05），4-PBA組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白水平降低（P<0.05）；與TGF-β1組相比，聯合組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白水平降低（P<0.05）（圖4、表3）。

圖4 各組細胞p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白表達

表3 各組細胞ER stress相關基因蛋白水平比較

3 討論

肺癌的發病率和死亡率均位居所有惡性腫瘤首位［12］，腫瘤細胞EMT是惡性腫瘤出現侵襲、轉移的重要作用機理，腫瘤細胞通過EMT獲得間質細胞形態和侵襲能力，可容易穿透基底膜進入腫瘤組織相鄰周圍組織，實現腫瘤細胞侵襲、遷移［13］。TGF-β1屬于具有自分泌、旁分泌功能的TGF-β超家族成員，可促進肝星狀細胞合成纖維連接蛋白、I型和IV型膠原，有利于細胞外基質合成，同時還可通過增強Smad信號誘導肺癌細胞EMT［14］。本研究結果發現隨著TGF-β1作用劑量增加，肺癌A549細胞的EMT現象更加顯著，證實TGF-β1確實可以誘導肺癌A549細胞EMT。

EMT發生機制較為復雜，近年來有學者認為腫瘤細胞MET可能與腫瘤微環境有關，其中ER stress可參與腫瘤細胞EMT過程［15］。ER stress是指由各種因素引起的內質網內的未折疊、錯誤折疊蛋白聚集，導致內質網功能紊亂，影響蛋白質合成，使未折疊蛋白反應激活［16］。本研究結果發現給予TGF-β1處理可以提高肺癌A549細胞的侵襲數目，而給予ER stress抑制劑4-PBA處理可以降低肺癌A549細胞侵襲數目，說明TGF-β1可以提高肺癌A549細胞的侵襲能力，給予ER stress抑制劑干預可以抵消部分TGF-β1促侵襲作用。本研究還發現TGF-β1處理能夠升高N-cadherin、vimentin、Snail1和Snail2 mRNA水平，降低E-cadherin mRNA水平，而4-PBA處理后上述指標的mRNA水平呈相反趨勢。E-cadherin對維持上皮細胞表型具有重要作用，可通過胞外的免疫球蛋白結構域使各分子間產生相互連接，同時經過胞內α、β連接素和肌動蛋白骨架連接，最終形成穩定的胞間接觸，E-cadherin表達異常直接影響細胞的粘附能力［17］。N-cadherin在調節細胞間的粘附能力方面呈現出相反趨勢，當惡性腫瘤出現侵襲、遷移，其表達量升高。Vimenti屬于中間絲蛋白質，與微管、肌動蛋白微細絲共同組成細胞骨架。Snail是含有特殊結構的DNA結合蛋白，能識別E-cadherin啟動子并在E-box部位結合，抑制E-cadherin轉錄。柳惠斌等［18］研究表明肺腺癌細胞TGF-β1陽性表達顯著，可以通過誘導細胞EMT增強細胞侵襲、遷移能力。本研究結果也出現趨勢，說明TGF-β1誘導肺癌A549細胞EMT增強細胞的侵襲能力，同時也提示TGF-β1誘導肺癌A549細胞EMT作用機制可能與細胞的ER stress有關。

內質網是細胞合成、加工、修飾蛋白以及鈣離子存儲場所，當受到自由基、藥物刺激、感染時，未折疊蛋白、錯誤折疊蛋白均會堆積于內質網，誘發R stress。GRP78、XBP-1s是ER stress的標志性蛋白，在多種腫瘤組織中呈高表達，還與腫瘤的惡化程度、侵襲存在相關性。本研究結果顯示TGF-β1處理可以提高GRP78、XBP-1s蛋白表達和基因水平，而給予4-PBA處理可以降低該趨勢。Shin等［19］研究表明4-PBA能夠降低TGF-β1誘導的ER stress標志物水平，本研究結果也出現相似趨勢，說明TGF-β1誘導的肺癌A549細胞EMT可能通過ER stress發揮作用。本研究結果還發現TGF-β1處理可以升高肺癌A549細胞的p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白水平，4-PBA處理趨勢相反。Ak、PI3K對抗細胞凋亡具有促進作用，已有研究［20］表明TGF-β1誘導細胞EMT是通過調節PI3K/Akt途徑實現的，本研究結果也呈相似趨勢，說明TGF-β1誘導腫瘤細胞EMT與影響PI3K/Akt信號通路活性有關。

綜上所述，本研究主要是通過細胞體外實驗證明TGF-β1可誘導肺癌A549細胞EMT，其一部分作用機制可能是通過介導ER stress發揮促EMT作用，而在動物體內是否存在相似趨勢需要后續通過構架突變體小鼠給予探索。